两阶段调控优化保加利亚乳杆菌合成γ-氨基丁酸
摘要：保加利亚乳杆菌ATCC 11842是制备富含γ-氨基丁酸（GABA）发酵饲料的优良益生菌。菌株生长的最佳初始pH为6.0，最佳温度为35℃。GABA生物合成的最佳pH为8.0，最佳温度为40℃。两阶段发酵调控保加利亚乳杆菌ATCC 11842 生产GABA，GABA的产量达到5.98g/L，优化后GABA产量比优化前提高了153.39%。
研究表明，两阶段分开控制菌株生长和GABA合成的pH和温度，能显著提高 GABA的产量。该方法为用保加利亚乳杆菌ATCC 11842生产富含γ-氨基丁酸的发酵饲料提供了科学依据。
γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，具有降血压、改善脑机能、增强记忆、抗焦虑等生理功能（Kantachote等，）。GABA作为饲料添加剂，能够提高动物抗应激能力，改善胴体品质和提高生产性能（汪祥燕等)。潘雪梅等研究发现，GABA可以缓解奶牛夏季的热应激，提高奶牛免疫能力和机体的抗氧化能力。Park等研究结果表明，GABA作为饲料添加剂能显著提高蛋鸡的生产能力，改善鸡蛋品质。常见的生产GABA的益生菌主要有酵母菌和乳酸菌（Kang等）。管军军等认为，乳酸菌是定植在动物肠道中的益生菌，有利于动物的肠道健康，常被用于制备发酵饲料，有助于动物的健康养殖。徐秀景等研究表明，乳酸菌发酵制备的固态发酵饲料，能够改善猪肉的品质，提高育肥猪的生长性能。乳酸菌与GABA的联合生产，能够显著改善饲料的营养品质。沈雪娇等研究发现，产GABA的短乳杆菌P-14发酵饲料应用于育肥猪的饲养，能提高其生产性能，改善猪肉的品质，提高饲料的报酬率。
保加利亚乳杆菌ATCC 11842是一种在食品加工领域重要的益生菌，在乳制品和功能饮料加工过程中已展现出良好的应用前景（毛雪等）。在饲料加工领域，保加利亚乳杆菌ATCC 11842也具有良好的应用前景。本研究通过探索保加利亚乳杆菌ATCC 11842生物合成GABA的规律，为生产富含GABA的发酵饲料提供科学依据。
1.材料与方法
1.1 材料与试剂
GABA标准品、MRS培养基和谷氨酸钠均购于北京某科技有限公司；
苯酚、硼酸、硼砂、次氯酸钠、氢氧化钠和无水乙醇均购于国药集团化学试剂有限公司；
保加利亚乳杆菌ATCC 11842保藏于江汉大学湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心食品加工实验室。
1.2 仪器与设备
V-1600 紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；
TG165 型离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；
HH-2 型水浴锅：国华电器有限公司；
SPX-150B-Z 型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 菌体培养与 GABA 生物合成方法
菌体培养方法：保加利亚乳杆菌ATCC 11842活化培养基为MRS固体培养基，培养温度为30℃；保加利亚乳杆菌ATCC 11842生长培养基为MRS液体培养基，接种量为2%；生长液体培养基置于50mL离心管，装液量为48mL，调整液体培养基pH，控制培养温度，厌氧静置培养，培养36h；每个样品重复3次。
GABA生物合成方法：在菌体生长液体培养基中添加0.25g谷氨酸钠底物，调整液体培养基pH，控制培养温度，生物转化48h；每个样品重复3次。
1.3.2 菌体生物量测定方法
定时取0.5mL发酵培养基，6000r/min离心15min，弃上清液，用0.5mL无菌水悬浮菌体，在600nm条件下测定菌体光密度值（吴军林等）。在600nm波长条件下，绘制菌体生物量与光密度的标准曲线，从而计算出培养基中湿菌体的浓度。
1.3.3 GABA 样品制备及其检测方法
GABA样品制备：取1mL发酵液体培养基于1.5mL离心管，6000r/min离心10min，得到的上清液用于GABA含量的检测。
检测方法：取0.3mL上清液于25mL离心管中；依次加入0.2mL的0.2M硼酸盐缓冲液（pH9.0），1mL的6%苯酚溶液，0.8mL的5%次氯酸钠溶液，充分振荡混匀；置于沸水浴中保持10min；然后迅速置于冰浴中保持15min；剧烈振荡至显示蓝色；最后加入2mL的60%乙醇溶液；在645nm波长条件下检测光密度值（Zhang等）。
2.结果与分析
乳酸菌生物转化谷氨酸钠生物合成GABA分为两个阶段。第一阶段为乳酸菌的生长阶段，在此阶段需要提供乳酸菌良好生长环境，使乳酸菌达到最大的生物量；第二阶段是GABA的生物合成阶段，在此阶段需要控制谷氨酸脱羧酶良好的活性环境，谷氨酸钠在谷氨酸脱羧酶的催化作用下生物合成GABA（Ttt等）。Shi等研究表明用短乳杆菌静息细胞生物转化谷氨酸生成GABA有两个关键的控制因素，一是pH控制在4.5，二是温度控制在45℃。Peng等研究结果也表明分步控制温度和pH条件，用短乳杆菌CGMCC 1306生物转化谷氨酸能获得良好的转化效率。因此，本研究探索分两阶段分别控制菌株的生长和GABA的生物合成，以期提高GABA的产量。
2.1 pH 和温度对菌株生长的影响
由图1可知，pH能显著影响保加利亚乳杆菌ATCC 11842的生长。在菌株生长36h时，pH为5、6、7、8、9时的菌体生物量分别为11.60、17.10、15.58、13.93、9.48g/L。pH高于9时，菌株的生长受到显著抑制。pH为6时菌株的生长最佳。终产物乳酸的积累是抑制乳酸菌生长的重要原因，调节培养基初始pH会影响乳酸菌生长。闫征等研究表明，调节培养基初始pH，乳酸菌在pH6和pH6.5条件下，表现出较好的生长。杨静等的研究结果也表明，乳酸菌生长的最适pH为5.5~7.0。
由图2可知，温度能显著影响保加利亚乳杆菌ATCC 11842的生长。在菌株生长36h时，温度为25、30、35、40、45℃时的菌体生物量分别为13.60、15.44、16.90、15.62、5.40g/L。温度高于45℃，菌株生长受到明显抑制。其中35℃是菌株生长的最佳温度。王奎明研究结果表明，保加利亚乳杆菌在MRS培养基中和37℃条件下生长良好。培养基组分也会影响保加利亚乳杆菌的最适培养温度。曾少葵等以牡蛎酶解液为原料，保加利亚乳杆菌的最适生长温度为40℃。
2.2 pH 和温度对 GABA 生物合成的影响
pH和温度会影响酶分子的活性结构以及酶分子与底物的结合（周文斯；陈稳等）。调控反应的温度和pH对谷氨酸脱羧酶活性有重要影响，进而影响GABA的生物合成（Wu等；时粲等）。
保加利亚乳杆菌ATCC 11842在MRS液体培养基中生长36h时，培养基pH降为6.0，当添加0.25g谷氨酸钠后，培养基pH变为4.5。在此基础上调整发酵液的pH分别至5、6、7、8、9，温度为35℃，生物转化48h后，比较GABA的产量。由图3可知，pH能显著影响GABA的产量。在pH为5、6、7、8、9五个不同条件下GABA产量分别为3.25、3.30、3.75、5.0、3.71g/L。其中pH为8时GABA生物合成量最高。随着菌株的生长，菌株产酸也会使发酵液的pH降低。孟丹等研究表明，乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201生物合成GABA最佳初始pH为6.5，其发酵液中γ-氨基丁酸的质量浓度为0.22g/L。曾林等从四川泡菜中分离出一株具有产GABA能力的植物乳杆菌BC114，并对其发酵条件进行优化，结果表明，其最佳pH为5.50，GABA产量为3.82g/L。
由图4可知，温度能显著影响GABA的产量。在温度为25、30、35、40、45℃条件下的GABA产量分别为2.57、2.69、3.33、4.77、3.96g/L。其中40℃是GABA生物合成的最佳温度。韩昱姝等从泡菜中筛选出一株短乳杆菌LF-fb-017，其GABA产量可达1.68g/L，其最佳生物转化温度为37℃。Park等研究结果也表明，乳酸菌来源的谷氨酸脱羧酶最佳活性温度为41℃。
2.3 优化前后 GABA 产量的比较
参照前期研究方法，保加利亚乳杆菌ATCC 11842在MRS培养基中生物转化谷氨酸钠合成GABA，在自然pH和恒温30℃条件下，GABA产量为2.36g/L（Wang等）。用两阶段调控生物合成GABA的方法，菌株在初始pH6.0，温度35℃条件下生长36h，再调整发酵液pH至8.0，温度调整至40℃，生物转化48h，GABA的产量达到5.98g/L，如图5。优化后GABA的产量较优化前GABA的产量提高了153.39%。张竺英等（2014）从豆豉中筛选的产γ-氨基丁酸的乳酸菌HY15，该菌株在含1％（W/W）谷氨酸钠的MRS发酵培养基中，37℃厌氧培养48h后，发酵液中GABA产量达到0.161g/L。史晓萌等从哈萨克族传统发酵食品中筛选出一株乳酸乳球菌KCH1，GABA产量达329.81mg/L。吴非等利用紫外线对GABA高产菌株保加利亚乳杆菌L2进行诱变处理，获得高产GABA突变菌株L2-4，其在含有1%L—谷氨酸改良MRS培养基中的GABA产量达到4.235g/L。因此，保加利亚乳杆菌ATCC 11842 GABA的合成能力显著高于上述报道的乳酸菌株。
3.结论
本试验结果表明，对菌株生长和GABA生物合成的pH和温度进行两阶段分开控制，能显著提高GABA的产量。菌株在初始pH 6.0，温度35℃条件下生长36h后，再调整发酵液pH至8.0，温度40℃，GABA的产量达到5.98g/L。优化后GABA的产量较优化前GABA的产量提高153.39%。
多功能生物发酵活菌肽-产品说明书
打开本产品包装袋，香气四溢（养殖场拌料饲喂运用后，整个养殖栏舍中都香气扑鼻，让人非常震撼，这种宜人的香醇味是一般产品所无法比拟的），得益于高端的固态发酵技术与大量能量和蛋白饲料的运用，本品1公斤相当于约1.5~2公斤全价饲料能量，有效活菌数高达约200亿/克，结合中草药辅助形成对动物肠道极好的保健效果，健康水平提高大幅度减少用药成本降低死亡淘汰率。显著提高饲料消化吸收率，减少排粪量且粪便水份少；生长加速能够提前出栏；延长产蛋周期且坏蛋比例下降明显；养殖环境臭味氨气快速下降，肉蛋奶品质改善明显。
本产品由多种特异性乳酸菌、产酶芽孢杆菌、布拉氏酵母、产朊假丝酵母、酿酒酵母、双歧杆菌、丁酸梭菌与部分中草药发酵而成的高活性发酵饲料产品。
【主要成分】
高浓度复合乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、淀粉酶、复合酶制剂、活性小肽、酸化剂、多维、复合氨基酸等。
【主要载体】
豆粕、鱼粉、玉米粉、玉米胚芽、小麦次粉及核心原料，辅料部分为中草药（主要有黄芪、大青叶、香附、白术、枳壳、槟榔、茯苓、金银花、甘草等18味，2021年1月份再次升级后本品每袋不少于3公斤中草药）。
【规格指标】
粗蛋白≥18%；粗脂肪≥5%；粗灰分≤6%；有效活菌数不同储存时间在20-200亿CUF/g。包装规格为20公斤/袋。本产品复合饲料卫生标准。
打开多功能生物发酵活菌肽香气四溢并可以长时间保持，多功能生物发酵活菌肽包装内物料，颜色会随着时间长短而有所变化，样品打开后由于接触空气在一周左右可能会霉变，请及时饲喂或者丢弃。产品打开包装后要及时密封，并请在7-15天内喂完，以免接触空气后产生霉变影响质量。
【产品功效】
1.维护肠道粘膜健康，促进亚健康动物群体快速改善，提高畜禽对营养物质的吸收，对比提高日增重。
2.所选的有益菌的代谢产物可迅速弥补消化道中内源酶的不足，维护肠道微生态平衡，降低肠道负担，利于营养的吸收，防止畜禽营养性肠道健康问题的发生。
3.预防幼小畜禽由于更换饲料、抓捕、运输等刺激性因素造成的应激反应。
4.提高钙、磷、铁等元素与有机微量元素的吸收，增加畜禽排卵数量，提高畜禽的产仔（产蛋）数量。
5.提高饲料消化利用率，促进饲料中碳水化合物的分解，促进饲料中非蛋白氨转化为高品质蛋白质，提高饲料利用率，提高增重和降低料肉比。
6.提高瘦肉率，降低背膘厚度，使臀肌、腿肌饱满发达，形体丰满结实，快速清除药残，改善酮体品质和风味，提高屠宰瘦肉率。
7.运用本品后轻度霉变饲料可以不再需要添加脱霉剂产品，本品的活性微生物代谢产生霉菌抑制复合物，有效抑制霉菌的生长，降低霉菌毒素的产生，降解部分霉菌毒素，达到解毒效果。较重霉变饲料建议不要使用或者另外添加脱霉剂。
8.改善养殖环境，快速降低养殖环境臭味和氨气；减少动物粪便排泄量，粪便自然成形并减少粪便含水量，加快动物粪便自然发酵速度。
客户反馈使用后蛋鸡增产明显
【用法用量】
猪各阶段、牛羊、鸡鸭鹅家禽与特种养殖上均可使用。混合饲料中饲喂，也可以单独少量直接补充洒在料槽中饲喂。由于本品1公斤相当于约1.5~2公斤全价饲料能量，在每吨全价饲料中添加本品1包（20公斤）的情况下，可以减少全价饲料40公斤（1包）的使用量。
1.养猪上的运用：日常中每吨饲料使用本品1包（20公斤），初次使用与在周围疫情严重、泌乳期、出栏前1个月可以增加2-4倍的使用量。仔猪、肉猪、母猪各阶段都可以使用，用药和免疫期间不需要停止无副作用。可以与部分全价饲料简单混合后进入自动供料系统中运用。
2.家禽上的运用：每吨饲料使用本品1包（20公斤），初次使用与在周围疫情严重、蛋禽、出栏前1个月可以增加2-3倍的使用量。
3.牛羊上的运用：每1吨精饲料中使用本品3-5包。
4.特种动物养殖上的运用：每1吨饲料中添加本品2包，出栏前一个月增加一倍的使用量；部分昆虫养殖上运用本品也有恢复肠道健康和解决一些疑难问题。
5、直接撒喂方法：如果混料不方便等，可以将本产品单独直接洒到畜禽养殖区投喂，撒喂比例按照1吨饲料运用本品1包的使用量饲养区域，尽量撒散开确保每只畜禽都能够吃到。由于本产品非常香醇可口，畜禽都会抢吃干净。每天撒喂1次即可。
6、饮水中运用本产品的方法：规模养殖场自动饮水系统的操作需要将本产品1包放入网纱袋内，浸入到1吨水中来回揉搓3分钟以上，大部分本产品会融入水中，剩余不溶解的残渣直接投喂或者拌料。每吨饮水中添加1公斤红糖并且静止半小时以上再给动物饮水效果更好；小规模养殖场或者不是自动饮水的养殖场，将本产品1包直接倒入到1吨饮水中后搅动一下给动物饮用即可（加入1公斤红糖静止半小时以上效果更好）。本产品益生菌数量多，且中草药也会大部分会释放出来，因此饮水也是能够达到很不错的效果。
【视频】部分发酵饲料养猪鸡鸭带给你无臭味健康无抗养殖效果
广西助农畜牧科技有限公司提供全方位支撑
2020年已全面禁抗，我们之前经常在饲料中添加的抗生素进行促生长行为将是违法，否则面临巨额罚单。如何既能够促进动物生长又能够形成无抗养殖呢？其实中草药在促进畜禽养殖健康和生长、改善肉蛋奶品质大有可为，特别是将中草药发酵后效果提升4-28倍等好处，这个实施方案比你想象中效果更好，运用的没有不被效果折服的，值得尝试验证
我们的技术仅需在出栏前半个月左右运用益生菌+酶制剂+中草药相关的无违禁安全产品，肉质改善非常显著，且可以批量化生产。
目前我们已经有了成熟的技术、产品和运用方案，且有大量成功案例，可以在短时间、批量化、安全无违禁地为您的养殖场生产出高品质的家畜、家禽、水产产品。
规模养殖场养殖公司我们提供产品样品、验证效果和通过检测后您再放心地规模化运用。
微信公众号：gxzn-99
微信号：gxzn07713815862
电话：0771-2204816，3800156,3815862
网站：www.fjc001.com， www.zn99.com
微店：weidian.com/?userid=1353707843
产品购买微信转账请添加18076549930或15578100088为好友（还可以咨询技术与业务问题）
相关链接——农业农村部鼓励企业和研发机构加快生物饲料、酶制剂、益生菌、植物提取物等抗生素替代产品开发，推动全行业抗生素减量替代，确保畜禽产品质量安全
- 上一篇：缓解猪场猪群热应激的措施 [2021-07-01]
- 下一篇：广东省廉江市这个猪场运用发酵中草药技术防控非瘟效果显著，猪场健康栏舍干净臭味氨气问题得到改善 [2021-06-30]
