导读

   目前，在不添加抗生素和促生长剂等有害添加剂条件下，提高畜产品品质成为迫切需要解决的问题。液体发酵饲料的研发为开辟绿色饲料提供了新的解决思路，作为一种新型饲料，液体发酵饲料在欧洲已得到广泛应用，在断奶仔猪上的优势也被大量试验结果所证明。

    液体发酵饲料作为一种无抗饲料，在保留了固态饲料物理性质上优点的同时，具有使用安全、适口性好和动物喜采食等优点，可避免了仔猪挑食，还可提高仔猪采食量和生长性能，降低胃肠道pH值和大肠杆菌数量。另外，优质液态发酵饲料的pH应低于4.5，植物乳杆菌活菌数高于109CFU/mL，乳酸浓度高于150mmol/mL。高浓度的乳酸可降低饲料pH，有利于提高饲料适口性，抑制病原菌增殖。乳酸浓度高于7mmol/mL时，可抑制沙门菌增殖；乳酸浓度高于100mmol/mL时，可抑制大肠杆菌增殖。

    本试验液体饲料发酵用的植物乳杆菌是肠道常在菌，它可以减少赖氨酸的生物降解，提高饲料价值；改变肠道内环境，抑制有害菌繁殖；调整胃肠道菌群平衡，增强畜禽的免疫抗病能力；可提高畜禽的生长速度、奶肉蛋产量和饲料转化利用率。因此植物乳杆菌可广泛应用于动物饲喂、动物饲料和青贮饲料中，对畜牧业的生产有着重要意义。另外，菌种的好坏会直接影响液体发酵饲料的发酵效果和饲喂效果。有研究表明，酵母菌发酵会导致日粮的适口性降低，影响畜禽的采食量；原料中可能存在其他不适于发酵的菌种或者其含量太低不足以抑制有害菌的滋生。近年来，研究人员致力于研究自然存在的植物乳杆菌是否适合进行液体发酵饲料的有益微生物，在发酵系统中接种特定的有益菌是否会更好。因此，开发一种适宜的菌种，是液体发酵饲料的关键技术之一。

    紫外线照射用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，紫外辐照设备简单、效果明显，是微生物菌种选育的首选诱变因子。诱变育种是指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的或多种诱变因子中，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。迟乃玉等利用紫外线（UV），硫酸二乙酯（DES），亚硝基胍（NTG）复合诱变，筛选出一株超氧化物歧化酶（SOD）产量较高的乳酸菌菌株，但对植物乳杆菌进行诱变筛选高产乳酸菌株的相关研究并未见报道。通过筛选、驯化及生长促进因子的选择来提高乳杆菌的产乳酸能力为一种行之有效的方法。对植物乳杆菌进行液体发酵，应精选产乳酸能力强、发酵速度快等性能指标优良的菌株。优良菌株的筛选和利用已经成为液体发酵前必须进行的一项基础性工作，菌种的质量直接影响着液体饲料发酵的效果及最终发酵产品的质量。本研究对植物乳杆菌的细胞菌悬液进行紫外照射，选育具有良好发酵性能的液体发酵饲料专用乳酸菌，为液体发酵饲料的研制提供理论依据。

1.1 出发菌株

      植物乳杆菌1.1856（Lactobacillus plantarum）购于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）。

1.2 仪器设备

      智能生化培养箱、恒温仪、高速冷冻离心机、可见分光光度计、漩涡振荡器、全温振荡器、电热恒温培养箱、座式自动电热压力蒸汽灭菌器、净化工作台、可见分光光度计、冰箱及生物实验室常用设备等。

1.3 培养基及试剂

        斜面及平板培养基：MRS肉汤培养基（购于索莱宝）加琼脂和蒸馏水，调节pH至6.2±0.2。

初筛培养基：MRS肉汤培养基加碳酸钙、琼脂和蒸馏水，调节pH至6.2±0.2。

种子培养基：MRS肉汤培养基加蒸馏水，调节pH至6.2±0.2。

发酵全价料培养基：基础日粮配方见表1。

乳酸测试盒：购于南京建成生物工程研究所。

2.1 菌种活化

    取植物乳杆菌安瓿管，在超净台中用酒精脱脂棉对安瓿管外表面进行消毒后，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热的安瓿顶端使之破裂。将已经破裂的安瓿顶端敲下，取0.3 mL液体培养基滴入管内，轻轻震荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状. 吸取全部菌悬液，移植于斜面中，37 ℃培养24 h，并连续两次继代培养。

2.2 选育种子液的制备

    将已活化好的植物乳杆菌斜面挑取一环接种到液体培养基中，37 ℃条件下静置培养24 h，然后从培养的菌液中取5%菌种，转接到液体培养基中37 ℃静置培养24 h，制成选育种子液。

2.3 生长规律曲线的测定

    从上述培养的选育种子液中取5%菌种转接到液体饲料中（V 水∶V 料=2.5∶1）进行培养试验，以未接种的液体饲料作空白，采用比浊法测定，在波长600 nm条件下，分别测定该菌种在培养0、6、12、18、24、30、36、42、48 h后的吸光度值. 以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，作植物乳杆菌的生长曲线。

2.4 菌株的紫外诱变

    取菌体斜面，在无菌条件下，加入无菌水5 mL，刮下表面培养物制成悬液，5000 r/min离心5 min，再用生理盐水洗涤、离心2次. 用10倍稀释法将菌悬液细胞稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同浓度，再各取5 mL置于直径为9 cm的无菌平皿，内置一个消毒转子，将盛有制备好的菌悬液的培养皿放在磁力搅拌器上，放置在紫外诱变箱中，利用15 W紫外灯，照射距离25 cm，设置照射时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 min6个梯度处理. 紫外照射后开启红光，分别吸取紫外照射的菌悬液0.1 mL涂布于MRS培养基上，每个稀释度涂3个平板. 以同样的操作方法，将未经紫外线处理的菌液稀释涂布于MRS培养基上作为对照. 将上述涂匀的平板，用黑布裹好，置于37 ℃恒温培养箱中避光培养24 h. 将培养好的平板取出进行计数，找出最佳照射剂量，致死率计算公式为：

致死率（%）=（紫外照射前菌液中活菌数-紫外照射后菌液中活菌数）/紫外照射前菌液中活菌数×100%.

2.5 筛选方法

2.5.1 MRS-CaCO₃初筛

    通过植物乳杆菌产生的乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成溶钙圈大小，判定植物乳杆菌产乳酸能力的大小。

2.5.2 复筛

    选取初筛产乳酸能力相对较高的几株菌株，接种到液体发酵饲料中进行37 ℃振荡培养，测定产生乳酸情况，筛选出产乳酸能力最大的菌株作为目标菌株。

2.6 菌株的稳定性试验

     将诱变菌株连续传代发酵，每次传代都要进行乳酸的测定，观察诱变菌株产乳酸的稳定性。

2.7 乳酸的测定

     采用乳酸测试盒。