啤酒酵母和乳酸菌发酵棕榈粕渣饲料制备工艺的响应面优化

2020-08-07 16:28:42 点击：

摘要：通过单因素实验和响应面法对啤酒酵母和乳酸菌发酵棕榈粕渣饲料制备工艺进行研究。结果表明:基料制备最佳发酵条件为发酵时间5d、棕榈仁渣目数70目、菌料比1∶103、发酵温度30℃、含水量36%，该条件下基料中总菌落数为7.20×1010个/g;发酵产物最佳发酵条件为发酵温度30℃、棕榈果渣与空果串配比1∶2、棕榈果渣及空果粉碎长度4cm、配料比1∶10(基料与棕榈果渣和空果串质量比)、含水量35%、发酵时间36d，该条件下发酵产物营养成分OD值为0.966。对发酵饲料主要成分进行分析，其粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、含水量分别为7.20%、7.61%、26.20%、5.20%、0.38%、0.26%、16.20%，总菌落数为9.0×107个/g。该发酵方法工艺简单，具有良好的工业化生产前景。

油棕榈(Trachycarpus fortunei(Hook，f.)H.Wendl.)原产于非洲西部海岸，后传入马来西亚和印度尼西亚等东南亚各国并被广泛种植。棕榈粕渣是油棕榈果实提油后的副产品，根据提油工艺时序，棕榈粕渣由空果串、果渣、仁渣3部分组成。棕榈粕渣价格低廉、资源丰富、无毒副作用，从能量和蛋白等营养成分看，是一种开发潜力巨大的饲料资源。目前，棕榈粕渣中的仁渣通过部分替代或添加的形式被广泛应用于家禽饲料和反刍动物饲料，并且在鸡、鸭、鱼、鹅、猪、牛、羊等动物饲喂实验中展现出良好的经济效益。棕榈仁渣以其粗蛋白、粗脂肪、能量高的特点在畜禽饲料中日渐广泛应用，而棕榈空果串和果渣则成了废料，除了少部分用于肥料使用，大多数以废弃物的形式被丢弃，资源浪费严重，油棕榈资源未能得到充分的综合利用，同时也存在棕榈仁渣过量添加导致的日粮纤维较高和饲料消化率降低等问题。

随着饲料工业的发展，固态发酵饲料作为一种绿色环保的新型饲料，越来越受到动物养殖户的青睐。固态发酵饲料主要通过人为控制有益微生物的生长代谢活动，在提高饲料营养价值(蛋白质、氨基酸、维生素等)水平、增加饲料中益生菌数量的同时减少饲料抗生素应用，降解饲料中抗营养因子，使畜禽更容易采食、消化和吸收且无毒害作用，是未来饲料的发展趋势。固态发酵饲料提高饲料价值主要采用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸菌、戊糖片球菌、酵母菌、黑曲霉和米曲霉等。酵母菌在发酵过程中能够分泌大量水解酶类，利用发酵底物中的无机氮源和碳水化合物合成微生物蛋白，有效降解抗营养因子，同时产生具有生物活性的物质。乳酸菌发酵饲料不仅营养价值及利用率高，而且乳酸含量极其丰富，拥有独特的气味，诱食效果良好，能够增加动物进食量。经过微生物复合菌发酵的固态发酵饲料能增加反刍动物瘤胃纤维分解菌(黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌)和乳酸产生菌(嗜酸乳酸杆菌和牛链球菌)数量，进而提高饲料消化率。

本研究采用啤酒酵母和乳酸菌对棕榈仁渣进行厌氧发酵(基料制备)，以啤酒酵母和乳酸菌发酵制备的发酵基料和棕榈果渣、棕榈空果串为原料进行二次厌氧发酵，在确定单因素的基础上利用Box-Behnken响应面分析法分别对影响基料中总菌落数和发酵产物营养成分OD值的主要参数进行优化，确定数学模型及最佳工艺条件，旨在为棕榈粕渣资源高值化利用及发酵饲料工业化生产提供理论指导及依据。

1材料与方法

1.1 实验材料

棕榈粕渣为马来西亚国立大学提供，由Sime Darby公司提油后的油棕榈果仁渣、果渣及空果串组成，其主要成分见表1。

饲料发酵菌种为啤酒酵母和乳酸菌，购自上海炎地农业科技有限公司，其中啤酒酵母有效菌种数量≥200亿个/g，乳酸菌有效菌种数量≥30亿个/g。

FL-30B万能粉碎机，METTLER PM 200电子天平，LDZH-200KBS立式高压蒸汽灭菌器，SHP-250智能生化培养箱，XSM-20生物显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 基料的制备

棕榈仁渣粉碎后过筛，精确称取20.00g，置于650mL培养瓶中，参考预实验，加入0.25%红糖水，盖上透气盖，121℃灭菌40min，冷却至室温后加入啤酒酵母和乳酸菌的混合菌粉，盖上密封盖，放入生化培养箱进行厌氧发酵。

1.2.2 发酵产物的制备

棕榈果渣及空果串粉碎后，精确称取25.00g，121℃灭菌40min后在(60±2)℃条件下干燥24h，冷却备用。精确称取一定量的基料与备用棕榈果渣及空果串充分混合至于真空袋中，加入无菌水，排除空气封口，放入生化培养箱进行厌氧发酵。

1.2.3 基料和发酵产物中总菌落数的测定

精密称取基料或发酵产物0.10g至灭菌试管中，吸取2mL无菌水稀释，摇匀，参照ISO 4833—2003方法，用血球计数板在显微镜下计算基料和发酵产物中总菌落数。

总菌落数=(啤酒酵母数+乳酸菌数)×稀释体积/棕榈粕渣发酵饲料称取质量

1.2.4 基料和发酵产物成分分析

参照GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 6434—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2002、GB/T 6437—2002和GB/T 6435—2014进行基料和发酵产物中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、含水量的测定。

1.2.5 发酵产物营养成分归一化值

以发酵产物的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、水分含量和总菌落数为指标采用Hassan法进行归一化处理，对取值越小越好的因素(粗纤维、粗灰分)和取值越大越好的因素(粗蛋白、粗脂肪、钙、磷、总菌落数)分别进行数学转换求归一值dmin和dmax，各指标归一值求算几何平均数，得总评归一值OD。公式如下:

dmin=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)

dmax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

OD=(d1d2d3…dk)1/k式中:d为单指标评价值;Yi为指标中第i个值;Ymin为指标中最小值;Ymax为指标中最大值;OD为总评归一值;k为指标数。

1.2.6 数据统计分析

所有实验平行3次，结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS19.0统计软件中的One-way ANOVA进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较;采用Design-Expert 10.0.4软件中的F检验(tape III)对数据进行响应面优化分析;采用Origin 9.4制图。

2结果与分析

2.1 基料制备实验结果与分析

2.1.1 单因素实验

在基料制备过程中，为使啤酒酵母和乳酸菌始终保持最佳生长状态，固定发酵时间为5d，通过Plactett-Burman实验选取显著影响基料总菌落数的4个因素(仁渣目数、菌料比、发酵温度、含水量)设计单因素实验。

2.1.1.1 仁渣目数的影响

在菌料比(质量比，下同)1∶80，发酵温度28℃，含水量30%，棕榈仁渣目数分别为10、20、40、60、80目条件下，测定基料中总菌落数，分析仁渣目数对啤酒酵母和乳酸菌发酵棕榈仁渣的影响，结果见图1。注:图中相同字母表示总菌落数之间差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示差异显著(P＜0.05)，下同。图1仁渣目数对总菌落数的影响由图1可知，当棕榈仁渣目数在10～60目时，基料中总菌落数随着棕榈仁渣目数增大而显著增多(P＜0.05)，当棕榈仁渣目数在60～80目时，基料中总菌落数随着棕榈仁渣目数增大而显著降低(P＜0.05)，这可能是由于当棕榈仁渣目数为60目时，啤酒酵母和乳酸菌与棕榈仁渣有效接触面积趋于最大，随后棕榈仁渣因自重影响发生粘黏，有效接触面积减少，啤酒酵母和乳酸菌无法充分利用棕榈仁渣营养物质生长发酵。故棕榈仁渣目数选择60目为宜。

2.1.1.2 菌料比的影响

在仁渣目数60目，发酵温度28℃，含水量30%，菌料比分别为1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶120条件下，测定基料中总菌落数，分析菌料比对啤酒酵母和乳酸菌发酵棕榈仁渣的影响，结果见图2。

由图2可知，当菌料比在1∶80～1∶100时，基料中总菌落数随着菌料比的增大呈显著增加趋势(P＜0.05)，继续增大菌料比，总菌落数显著降低(P＜0.05)，这可能是棕榈仁渣营养物质已被啤酒酵母和乳酸菌分解利用完毕，微生物细胞停止生长甚至开始死亡所造成的结果。因此，菌料比选择1∶100为宜。

2.1.1.3 发酵温度的影响

在仁渣目数60目，菌料比1∶100，含水量30%，发酵温度分别为24、26、28、30、32℃条件下，测定基料中总菌落数，分析发酵温度对啤酒酵母和乳酸菌发酵棕榈仁渣的影响，结果见图3。

由图3可知，当发酵温度在24～30℃时，基料中总菌落数随着发酵温度的上升呈显著增加趋势(P＜0.05)，继续升高发酵温度，总菌落数略有降低(P＞0.05)，这是因为随着温度的升高酶反应速度加快，啤酒酵母和乳酸菌细胞生长代谢加快，当温度高于30℃时酶失活速率大于微生物细胞生长代谢速率，导致微生物细胞衰老加快。故发酵温度选择30℃为宜。

2.1.1.4 含水量的影响

在仁渣目数60目，菌料比1∶100，发酵温度30℃，含水量分别为30%、35%、40%、45%、50%条件下，测定基料中总菌落数，分析含水量对啤酒酵母和乳酸菌发酵棕榈仁渣的影响，结果见图4。

由图4可知，当含水量由30%增至35%时，基料中的总菌落数随着含水量的增大而显著增加(P＜0.05)，随着含水量的继续增加，总菌落数呈逐渐降低趋势(P＜0.05)，这可能是由于适宜的含水量使得棕榈仁渣的细小颗粒之间存在一定的空隙和合适的疏松度，有利于微生物进入，在增大微生物与棕榈仁渣表面接触面积的同时排出微生物菌体代谢所产生的CO2，促进微生物菌体生长。故含水量选择35%为宜。

2.1.2 响应面优化实验

2.1.2.1 响应面实验设计及结果

在单因素实验基础上，采用中心组合设计原理，以仁渣目数(A)、菌料比(B)、发酵温度(C)和含水量(D)为响应变量，基料中总菌落数为响应值，采用Box-Behnken设计进行四因素三水平的响应面优化实验，响应面优化实验共设计29个实验点。Box-Behnken实验因素水平见表2，Box-Behnken实验设计及结果见表3。

利用Design Expert10.0.4软件对表3实验数据进行多元回归拟合，得到总菌落数对仁渣目数、菌料比、发酵温度和含水量的二次多项式回归方程:总菌落数=7.35+0.22A+1.22B+0.41C+0.28D+0.011AB-0.002AC-0.12AD+0.015BC-0.18BD-0.017CD-0.13A2-3.86B2-1.29C2-0.72D2。

该模型的分析结果及模型系数显著性检验见表4。

由表4可知，二次回归模型F值为154.690，P＜0.0001，表明模型极显著。失拟项P=0.3088＞0.05，失拟项差异不显著，说明实验数据均可用此回归模型描述，未知因素对实验结果影响很小。模型决定系数R2=0.9936，说明99.36%的实验数据变异性均可用此回归模型解释，模型可信度较高，该方程能很好地与实际情况拟合，较好地反映了基料中总菌落数与仁渣目数、菌料比、发酵温度和含水量之间的关系，因此该回归方程可较好预测总菌落数随各参数的变化规律。校正系数R2Adj=0.9872，说明实验结果有98.72%受各因素的影响。综上所述，该模型可用于总菌落数分析和预测。通过表4中F值可判断各自变量对因变量的影响依次为B＞C＞D＞A，即菌料比对总菌落数的影响最大(P＜0.01)，其次为发酵温度(P＜0.01)、含水量(P＜0.01)和仁渣目数(P＜0.01)。由回归方程和方差分析可知，二次项中B2、C2、D2对总菌落数的影响达极显著水平(P＜0.01)。

2.1.2.2 工艺条件的优化

根据Box-Behnken实验结果，结合回归模型，预测基料制备的最佳工艺条件为棕榈仁渣目数75.92目、菌料比1∶103.14、发酵温度30.81℃、含水量35.53%，此条件下总菌落数为7.58×1010个/g。

2.1.2.3 模型验证

为了验证响应面模型的可预见性，同时为了简化实验操作，将基料制备工艺的最佳发酵条件修正为棕榈仁渣目数70目、菌料比1∶103、发酵温度30℃、含水量36%，该条件下进行3次平行实验，总菌落数达到7.2×1010个/g，RSD为4.42%，与模型预测值误差为5.01%。经SPSS下ANOVA分析，验证实验总菌落数与预测总菌落数差异不显著(P=0.056＞0.05)。说明该模型可以有效预测基料制备过程中的总菌落数，优化结果可靠，可用来指导啤酒酵母和乳酸菌对棕榈粕渣的发酵工艺。

2.2 发酵产物实验结果与分析

2.2.1 单因素实验

在产物发酵过程中，为使发酵产物的营养成分归一值达到最好，固定发酵温度为30℃，棕榈果渣与空果串配比为1∶2。通过Plactett-Burman实验选取显著影响发酵产物营养成分OD值的4个因素(棕榈果渣及空果串的粉碎长度(以下简称粉碎长度)、基料与棕榈果渣和空果串配料比(以下简称配料比)、含水量、发酵时间)设计单因素实验。

2.2.1.1 粉碎长度的影响

在配料比1∶8(质量比，下同)，含水量30%，发酵时间30d，粉碎长度分别为1、3、5、7、9cm条件下，测定发酵产物OD值，分析粉碎长度对发酵产物营养成分的影响，结果见图5。

由图5可知，当粉碎长度在1～5cm时，发酵产物营养成分OD值随粉碎长度的增长而呈显著增加趋势(P＜0.05)，继续增长粉碎长度，营养成分OD值开始显著降低(P＜0.05)，这说明棕榈果渣和空果串粉碎长度过长，会致使其与基料混合不均匀，从而影响啤酒酵母和乳酸菌对棕榈果渣和空果串的发酵。故粉碎长度选择5cm为宜。

2.2.1.2 配料比的影响

在粉碎长度5cm，含水量30%，发酵时间30d，配料比分别为1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12条件下，测定发酵产物OD值，分析配料比对发酵产物营养成分的影响，结果见图6。

由图6可知，当配料比在1∶8～1∶10时，发酵产物营养成分OD值随配料比的增大而呈显著增加趋势(P＜0.05)，继续增大配料比，营养成分OD值显著降低(P＜0.05)，这说明配料比过小，会致使菌落数剧增过快，从而产生过多的代谢废物，导致菌种容易衰老，不利于发酵产物营养成分的提高，配料比过大，总菌落增长缓慢，培养时间长，使发酵周期延长，导致发酵成本的提升，同时会降低菌种活力，从而使菌种降解底物能力下降，营养成分含量降低。配料比为1∶10时，既能保证合理缩短发酵周期，又能得到较高的营养成分含量。故配料比选择1∶10为宜。

2.2.1.3 含水量的影响

在粉碎长度5cm，配料比1∶10，发酵时间30d，含水量分别为25%、30%、35%、40%、45%条件下，测定发酵产物OD值，分析含水量对发酵产物营养成分的影响，结果见图7。

由图7可知，当含水量在25%～35%时，发酵产物营养成分OD值随含水量的增大呈显著增加趋势(P＜0.05)，继续加大含水量，发酵产物营养成分OD值显著降低(P＜0.05)，这可能是由于含水量过低，导致固态介质中营养成分溶解度的下降及较低的基质膨润度，微生物生长受抑制，营养成分转换率降低，而含水量过高，导致基质颗粒间孔隙率的降低、黏性增加，增加了微生物菌体代谢所产生的CO2的传质阻力，抑制微生物生长发酵。故含水量选择35%为宜。

2.2.1.4 发酵时间的影响

在粉碎长度5cm，配料比1∶10，含水量35%，发酵时间分别为25、30、35、40、45d条件下，测定发酵产物OD值，分析发酵时间对发酵产物营养成分的影响，结果见图8。

由图8可知，当发酵时间在25～35d时，发酵产物营养成分OD值随发酵时间的延长而显著上升(P＜0.05)，继续延长发酵时间，发酵产物营养成分OD值呈平缓上升趋势(P＞0.05)，这是由于发酵过程中，产物营养成分浓度始终在变化，一般高峰生长阶段时间越长，其生产率越高，但到一定时间后生产率提高缓慢。为了获得更多的产物营养成分，时间过短，不足以获得所需的优质发酵产品;时间过长，由于环境已不利于菌体生长，往往会造成菌体消溶，同时增加生产成本。因此，发酵时间选择35d为宜。

2.2.2响应面优化实验

2.2.2.1响应面实验设计及结果

在单因素实验基础上，采用中心组合设计原理，以粉碎长度(X1)、配料比(X2)、含水量(X3)和发酵时间(X4)为响应变量，发酵产物营养成分OD值为响应值，采用Box-Behnken设计进行四因素三水平的响应面优化实验，响应面优化实验共设计29个实验点。Box-Behnken实验因素水平见表5，Box-Behnken实验设计及结果见表6。

利用DesignExpert10.0.4软件对表6实验数据进行多元回归拟合，得到粉碎长度、配料比、含水量和发酵时间的二次多项式回归方程:OD值=0.95-0.025X1+0.17X2+0.026X3+0.049X4+0.001X1X2+0.026X1X3+0.024X1X4-0.021X2X3+0.002X2X4-0.005X3X4-0.019X21-0.53X22-0.088X23-0.18X24。

该模型的分析结果及模型系数显著性检验见表7。

由表7可知，二次回归模型F值为162.210，P＜0.0001，表明模型极显著。失拟项P=0.2341＞0.05，失拟项差异不显著，说明实验数据均可用此回归模型描述，未知因素对实验结果影响很小。模型决定系数R2=0.9939，说明99.39%的实验数据变异性均可用此回归模型解释，模型可信度较高，该方程能很好地与实际情况拟合，较好地反映了发酵产物营养成分OD值与粉碎长度、配料比、含水量、发132CHINAOILSANDFATS2020Vol.45No.3酵时间之间的关系，因此该回归方程可较好预测发酵产物营养成分OD值随各参数的变化规律。校正系数R2Adj=0.9877，说明实验结果有98.77%受各因素的影响。综上所述，该模型可用于发酵产物营养成分OD值分析和预测。通过表7中F值可判断各自变量对因变量的影响依次为X2＞X4＞X3＞X1，即配料比对发酵产物营养成分OD值的影响最大(P＜0.01)，其次为发酵时间(P＜0.01)、含水量(P＜0.05)和粉碎长度(P＜0.05)。由回归方程和方差分析可知，二次项中X22、X23、X24对发酵产物营养成分OD值的影响达极显著水平(P＜0.01)。

2.2.2.2 工艺条件的优化

根据Box-Behnken实验所得结果，结合回归模型，预测发酵产物制备的最佳工艺条件为粉碎长度3.94cm、配料比1∶10.16、含水量35.23%、发酵时间35.50d，此条件下OD值为0.976。

2.2.2.3 模型验证

为了验证响应面模型的可预见性，同时为了简化实验操作，将发酵产物制备工艺的最佳发酵条件修正为粉碎长度4cm、配料比1∶10、含水量35%、发酵时间36d，该条件下进行3次平行实验，OD值为0.966，RSD为1.66%，与模型预测值误差为1.02%。经SPSS下ANOVA分析，验证实验OD值与预测OD值差异不显著(P=0.376＞0.05)。说明该模型可以有效预测发酵产物营养成分，优化结果可靠，可用于指导啤酒酵母和乳酸菌对棕榈粕渣饲料的发酵工艺。

2.3 成分分析

优化条件下对基料和发酵产物进行主要成分分析，结果见表8。

由表8可知:棕榈仁渣经啤酒酵母和乳酸菌发酵后，粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、含水量分别为18.63%、17.50%、6.50%、3.86%、0.80%、0.78%、35.12%，总菌落数为7.2×1010个/g;发酵产物的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、含水量分别为7.20%、7.61%、26.20%、5.20%、0.38%、0.26%、16.20%，总菌落数为9.0×107个/g。

通过发酵产物替代部分传统粗饲料中玉米秸秆后进行肉牛喂养实验，肉牛健康状况良好，饲料消化吸收利用率高，育肥效果显著。因此，该研究可为啤酒酵母和乳酸菌应用于棕榈粕渣发酵饲料工业及棕榈粕渣资源高值化利用提供理论指导及依据。

3结论

本文采用啤酒酵母和乳酸菌对棕榈粕渣饲料基料(棕榈仁渣)的发酵条件和以制备的基料、棕榈果渣、棕榈空果串为原料进行二次发酵的发酵条件进行了研究，在单因素实验的基础上，利用Design Expert软件，运用Box-Behnken实验设计进行响应面分析，分别建立了基料中总菌落数和发酵产物营养成分OD值与发酵条件各因素间的拟合模型，对工艺条件进行了优化，获得了啤酒酵母和乳酸菌发酵棕榈仁渣的最佳工艺条件为发酵时间5d，棕榈仁渣目数70目，菌料比1∶103，发酵温度30℃，含水量36%;发酵产物的最佳工艺条件为发酵温度30℃，棕榈果渣与空果串配比1∶2，棕榈果渣及空果串粉碎长度4cm，配料比1∶10，含水量35%，发酵时间36d。在最佳工艺条件下，参照国家标准对基料和发酵产物主要成分进行分析，基料的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、含水量分别为18.63%、17.50%、6.50%、3.86%、0.80%、0.78%、35.12%，总菌落数为7.2×1010个/g;发酵产物的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、含水量分别为7.20%、7.61%、26.20%、5.20%、0.38%、0.26%、16.20%，发酵产物营养成分OD值为0.966，总菌落数为9.0×107个/g。验证及分析实验结果说明，该优化工艺方法合理可行。通过发酵产物替代部分传统粗饲料中玉米秸秆后进行肉牛喂养实验，肉牛健康状况良好，饲料消化吸收利用率高，育肥效果显著。

啤酒酵母和乳酸菌发酵棕榈粕渣饲料制备工艺的响应面优化

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