摘要：

为了提高桑叶的营养价值，进行了发酵桑叶的工艺优化研究。以发酵桑叶粗蛋白质和单宁含量为指标，以桑叶与麸皮质量比、菌种组合、接种量和发酵时间为影响因素，进行L9(34)正交试验，以确定最佳发酵条件。根据正交试验结果进行验证试验和对比试验。结果表明:1)正交试验优化组合为，桑叶与麸皮质量比为9∶1，菌种组合为酒窖片球菌+地衣芽孢杆菌，接种量为2%，发酵时间为4d。2)验证试验表明，优化组合发酵桑叶测得粗蛋白质含量为26.18%，单宁含量为4.73g/kg，均优于正交试验表中最优值。3)对比试验表明，与未发酵桑叶相比，发酵桑叶粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、磷含量显著提高(P＜0.05)，单宁、中性洗涤纤维、碳水化合物含量和PH显著降低(P＜0.05)。与未发酵桑叶相比，发酵桑叶精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、总非必需氨基酸、总氨基酸含量显著降低(P＜0.05)，而丙氨酸含量、总必需氨基酸/总氨基酸、总必需氨基酸/总非必需氨基酸显著提高(P＜0.05)。发酵桑叶的半胱氨酸+蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸组成均显著高于未发酵桑叶(P＜0.05)。由此可见，发酵桑叶的最佳条件是:桑叶与麸皮质量比为9:1，菌种组合为酒窖片球菌+地衣芽孢杆菌，接种量为2%，发酵时间为4d。发酵提高了桑叶的营养价值。

引言：

单宁是复杂的水溶性多酚化合物，存在于许多植物中，并可存在于树皮、树叶、树干、果实和根中。单宁能够络合蛋白质、氨基酸、大分子物质，对消化酶产生拮抗作用，阻碍营养物质的吸收，降低动物的消化率；并因其苦涩的味道减少动物的采食量，从而降低植物饲料的营养价值。桑叶资源丰富，富含粗蛋白质(CP)、氨基酸、维生素、矿物质，是一种较好的非常规饲料资源。但桑叶单宁含量较高，限制了其在畜牧业的应用。因此，有效降解单宁对提升桑叶的应用价值具有重要意义。物理加工技术可以有效地降解单宁，如高温、浸泡、煮沸、高压、挤压蒸煮等。尽管上述技术可以降解一些单宁，但也可能降低桑叶营养成分。另外，上述技术耗能成本较高，不利于可持续发展。因此，需要一种更合适的、高效降解桑叶单宁的技术。发酵是利用微生物将植物茎叶成分转化为微生物蛋白、活性小肽、活性物质的技术，能降解抗营养因子，提高饲料原料的营养价值。黑曲霉、地衣芽孢杆菌、酵母、乳酸菌可以高效地将高分子单宁降解为小分子物质。柔毛镰孢菌和球孢白僵菌等丝状真菌发酵显著减少了橄榄饼单宁含量。黑曲霉、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌发酵降低了辣木叶41%单宁含量，提高了44%CP含量。罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌发酵降低了朱缨花叶单宁含量。这些文献为发酵降解桑叶单宁提供了思路。但是，关于桑叶发酵工艺的研究很少，通过发酵技术降解桑叶单宁的研究更少，尚不清楚发酵条件如何影响桑叶单宁的降解。因此，本研究通过正交试验优化了提高桑叶CP含量同时降低单宁含量的发酵条件，研究了桑叶发酵基质组成、菌种组合、接种量及发酵时间对单宁降解的影响，并且探讨了发酵对桑叶营养成分的影响，以期为桑叶的应用提供参考。

试验设计：

将鲜桑叶切短(1～2cm)，按照一定比例添加麸皮混合均匀，按照所需菌种组合和接种量添加菌种并搅拌均匀，发酵基质未灭菌，基质pH自然状态(不调整pH)，每个呼吸袋装入200g发酵基质，密封发酵。在空调房内进行发酵，发酵温度为(25±1)℃。

结果：

1.正交试验极差分析

由表2可知，通过直观分析方法比较表中极差大小，对CP含量影响因素大小排序为:桑叶与麸皮质量比(A)、菌种组合(B)、接种量(C)、发酵时间(D)。根据Ki值的大小判断最优水平，得到各因素对CP含量的最优组合为A1B2C2D2。同理，对单宁含量影响因素大小排序为:菌种组合(B)、发酵时间(D)、桑叶与麸皮质量比(A)、接种量(C)，得到各因素对单宁含量的最优组合为A1B2C2D1。综合上述分析，桑叶发酵最优方案为A1B2C2D1或A1B2C2D2，即桑叶与麸皮质量比为9∶1，菌种组合为酒窖片球菌+地衣芽孢杆菌，接种量为2%，发酵时间为4或6d。

2.正交试验方差分析

由表3和表4可知，CP的校正模型P值为0.030＜0.05，说明校正模型对试验结果有显著影响，正交试验结果具有可信度。桑叶与麸皮质量比和菌种组合显著影响发酵桑叶CP含量，说明二者是影响发酵桑叶CP含量的主要因素。根据F值得到，对CP含量影响因素大小排序为:桑叶与麸皮质量比、菌种组合、接种量、发酵时间。对桑叶与麸皮质量比(A)分析，A1的CP含量显著高于A3(P＜0.05)，A2的CP含量与A1、A3差异均不显著(P＞0.05)，因此选择A1。同理，菌种组合(B)选择B2。桑叶与麸皮质量比(A)和菌种组合(B)对CP含量的最优组合为A1B2。同理，菌种组合和发酵时间是影响单宁含量的主要因素。菌种组合(B)和发酵时间(D)对单宁含量的最优组合为B2D1。综合CP和单宁含量的最优组合，得到桑叶发酵最优组合为A1B2CiD1。

3.对比试验

3.1营养成分

发酵桑叶颜色黄绿，有桑叶清香，味道酸甜。由表5可知，发酵桑叶CP和EE含量分别比未发酵桑叶提高了16.82%和30.57%(P＜0.05)。发酵桑叶粗灰分和磷含量显著高于未发酵桑叶(P＜0.05)。发酵桑叶单宁、NDF、碳水化合物含量分别比未发酵桑叶降低了56.40%、16.78%、7.29%(P＜0.05)。发酵桑叶pH显著低于未发酵桑叶(P＜0.05)。发酵桑叶与未发酵桑叶之间DM、CF、ADF、钙含量差异不显著(P＞0.05)。

3.2氨基酸含量

由表6可知，与未发酵桑叶相比，发酵桑叶精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、总非必需氨基酸、总氨基酸含量显著降低(P＜0.05)，而丙氨酸含量、总必需氨基酸/总氨基酸(TEAA/TAA)、总必需氨基酸/总非必需氨基酸(TEAA/TNEAA)显著提高(P＜0.05)。

3.3必需氨基酸组成

由表7可知，发酵桑叶的半胱氨酸+蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸组成均显著高于未发酵桑叶(P＜0.05)。与未发酵桑叶相比，发酵桑叶缬氨酸组成有提高的趋势(0.05≤P＜0.10)。未发酵桑叶和发酵桑叶的赖氨酸和亮氨酸组成高于鸡蛋蛋白和联合国粮农组织(FAO)模式，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸和总必需氨基酸组成高于FAO模式，稍低于鸡蛋蛋白模式，半胱氨酸+蛋氨酸组成低于鸡蛋蛋白和FAO模式。由此可见，未发酵桑叶和发酵桑叶的必需氨基酸组成较为均衡，发酵桑叶必需氨基酸组成优于未发酵桑叶。

结论:

发酵桑叶的最佳条件是:桑叶与麸皮质量比为9∶1，菌种组合为酒窖片球菌+地衣芽孢杆菌，接种量为2%，发酵时间为4d。发酵提高了桑叶CP、EE、粗灰分、磷含量，降低单宁、NDF、碳水化合物、非必需氨基酸含量和pH。

本产品是一种以高浓度乳酸菌和酵母菌等组合酶菌结合的复合专业饲料发酵剂产品，可以发酵我们常见的大部分饲料原料、农家饲料、农产品与食品加工下脚料，制作活性EM菌液与制作青贮饲料，具有发酵、除霉、降解纤维、提高发酵饲料营养与适口性且能够长时间保存等功能，具有操作简单成功率高、成本低廉等特点。

本产品符合饲料卫生标准

【生产许可证号】桂饲添（2021）H01001

【产品执行标准】Q/NNWR 02-2021（饲用复合微生物添加剂Ⅰ）

【适用对象】畜禽、水产、环保

【原料组成】酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌等，复合酶制剂与载体等。

【产品成分分析保证值】酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌等合计≥100亿cfu/g，水分＜9.0%。

净重：200 克/袋。

本产品是在活力99生酵剂的基础上的升级产品，升级了増香增甜等功能效果。

鉴别本产品真假与效果的简单方法：500毫升左右的矿泉水瓶子中放入约50克大米+300毫升35℃左右的温水，加入本产品5克，几个小时就会产生大量香醇气体，72小时内大米基本溶解为乳状。做试验时请切记要注意矿泉水瓶炸开的安全。

产品使用说明书

（一）制作加强型活性EM菌液

在非金属容器中将本品1包（200克）与1公斤红糖（也可以用5公斤大米或玉米等含淀粉类的饲料代替）放入约50公斤温水中，简单密封48小时后就变成了加强型活性EM菌液（每毫升活菌在100亿左右）。其使用方法如下：

1.在畜禽上的使用方法：根据不同动物与饲养周期按其饲料重量的0.1%-0.5%拌入饲料或饮水中后饲喂或饮用。

2.养殖场紧急除臭生物消毒：取加强型活性EM菌液兑水30倍清水，对产生臭味与异味的养殖区域、粪污水道、粪堆、污水池进行喷洒，以喷洒表面湿润为准，接待参观前1-3小时补喷一次效果更好。

3.制作青贮饲料：每吨青贮饲料中加入10公斤加强型活性EM菌液，简单喷洒在料上压实密封发酵15天以上。

4.养殖水产上的使用：每亩使用5公斤加强型活性EM菌液进行喷洒，晴天进行喷洒后注意增氧。

（二）制作各种发酵饲料

本品能够发酵木薯渣、豆渣、米粉面条加工下脚料、剩菜剩饭、米糠、统糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青黄秸秆、牧草、红薯藤、轻度霉变饲料等各种廉价饲料（下脚料）、各种饲料原料与全价饲料等，每500公斤待发酵原料加入本品1-2包（或50公斤上述加强型活性EM菌液）、20公斤以上的玉米粉或其它含淀粉类的饲料原料、1公斤食盐（含有足够食盐的原料就不添加），含水量调节到约60%，压实密封发酵2-7天左右有浓郁香味时即可使用。发酵后饲料的适口性、营养、消化率较未发酵前有明显提升。发酵后的饲料根据不同动物与不同饲养周期按照10%-50%与该动物其它全价饲料混合后饲喂（先少量饲喂适应后逐渐增加的原则），不可以单独饲喂或全部饲喂发酵饲料。

（三）发酵水产动物饲料成高浓度乳酸菌保健品

①部分发酵饲料运用：100公斤水产饲料、50公斤清水、本品1包密封发酵7天以上变成高浓度乳酸菌发酵饲料，以10%比例与水产动物饲料混合后饲喂，或者发酵饲料单独饲喂；②全部发酵饲料饲喂：也叫轻度发酵饲料技术，300公斤水产全价饲料、本品1包、水120公斤混合发酵24小时全部饲喂，这种预消化结合大量乳酸菌饲喂能够显著改善水产动物肠道健康、水质改善等优点。

（四）发酵部分禽粪做饲料

发酵鸡粪（鸽子粪、兔粪等）作猪、鱼等动物饲料，本品2包、100公斤玉米粉其它含淀粉类的饲料原料、500公斤鸡粪，加入适量麦麸或米糠调节含水量约为55%-60%，覆盖薄膜进行发酵，一周左右有浓郁香味时即可使用，可代替饲料20%左右，用于喂猪或鱼类等。

（五）发酵菜粕、棉粕、花生饼、茶枯脱毒

原料1000公斤，玉米面其它含淀粉类的饲料原料100公斤，食盐2公斤，含水量调节到55%左右，本品2包，简单地搅拌均匀，密封发酵15天以上成为高浓度乳酸菌小肽丰富的生物蛋白饲料，喂前摊开透气10分钟再作为蛋白质原料使用于自配饲料中，可以等蛋白代替豆粕和玉米粉如：17%的发酵菜粕=10%的豆粕+7%的玉米粉，降低成本提高使用效果。

（六）中草药及中药渣发酵方法

1.固态中草药发酵技术：将50公斤中草药粉碎，越细越好放入40公斤的35℃左右的温水中，加入玉米粉与豆粕各5公斤、本品1-2包、食盐100克，放入塑料容器内压实密封发酵7天以上后使用，密封可以保存一年以上，按照饲料比例的1%以上添加到饲料或饮水中使用。

2.液态中草药发酵技术：1公斤中草药+1包本品+1公斤红糖+20公斤清水混合在非金属容器中简单密封发酵72小时以上后使用。每吨饲料中添加10公斤或每吨饮水中添加5公斤。

（七）直接拌料或饮水、制粒饲喂、制作水料

根据不同动物在每吨饲料添加本品2-4包，直接拌料或每包加入1.5-2吨饮水中使用；本产品采用微生物多层包被技术，在每吨3包本品混合饲料中直接制粒，90℃下5分钟不会影响效果；动物采用水料水料（粥料）的制作：本品1-2包、500公斤全价饲料、1000公斤清水混合后发酵6小时以上后饲喂（预消化的轻度发酵模式），24小时内饲喂完。

（八）注意事项

1.发酵饲料时，请勿加入浓度较高抑菌剂的脱霉剂或抗生素（如土霉素），或发酵原料中带有较强杀菌物质可能导致发酵不成功；原料霉变稍重、发现发酵速度变慢或者温度偏低，可以增加2-3倍的使用量即可解决。

2.饲料中正常添加的抗生素不会造成对本品效果的影响，但在大剂量对动物治疗期间要会影响效果但无副作用（可以间隔4小时使用）。运用本品后的健康动物可以减少或停用抗生素的使用。

3.特别提醒：如果是第一次制作发酵饲料、需要发酵的原料霉变或变质较重、发酵环境温度较低（低于15℃）、粗纤维较高、需要加快发酵速度或者需要制作出更加香醇高品质的生物发酵饲料出来等情况，请按照本产品说明书使用量增加2-3倍的使用量即可。

【包装规格】200克/包，80包/箱。规模养殖场可以提供25公斤装或者进行产品定制。

【质保与储存】12个月，常温下于通风、阴凉、干燥处存放。

【生产企业】南宁微瑞生物科技有限公司（高新区科园大道58号）

【客服电话】400-030-9099

广西助农畜牧科技有限公司有7个专业现代生态养殖技术实战型团队，为全国养殖场进行非洲猪瘟防控技术、现代循环生态养殖场的规划、设计、建设、整改等服务；养殖场环保问题低成本解决方案（养殖场恶臭、氨气，苍蝇、污水、粪污资源化、病死动物无害化处理）与专业配套产品。帮助政府部门完成现代生态养殖、粪污资源化、病死动物无害化处理、粮改饲、秸秆综合利用、牧草产业等达标工作、培训工作（免费且有专业资料等），针对您当地制定专业方案，做出示范样板后确定效果再进行推广。

广西助农畜牧科技有限公司提供全方位支撑

广西助农公司有着20余年的生物发酵饲料经验，能够针对你的养殖场做出最适合的模式，我们的发酵技术不仅设施投资简单（仅需塑料袋或塑料容器等即可），且发酵成功率很高。最关键是制作出来的发酵饲料品质比一般更好（得益于先进的酶菌结合发酵剂与经验总结），能够为你生产出低成本、养殖环保无抗优质的动物产品出来，大量成功案例可以验证。提供上门服务（快速解决家禽养殖上的疾病、环保、肉品质等问题）。

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相关链接——农业农村部鼓励企业和研发机构加快生物饲料、酶制剂、益生菌、植物提取物等抗生素替代产品开发，推动全行业抗生素减量替代，确保畜禽产品质量安全