1.1 材料

1.1.1 样品

牛粪、全株玉米青贮、土壤、牛奶、实验室保存的菌株等。

1.1.2 试验菌株

黄曲霉（Aspergillus flavus），由河北农业大学真菌毒素与分子病理学实验室提供。

1.1.3 培养基

发酵培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠8.5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、葡萄糖1 g/L，pH 6.5 

香豆素培养基：KH₂PO₄ 0.25 g/L、MgSO₄ 0.205 g/L、KNO₃ 0.5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 0.5g/L、CaCl₂ 0.004 g/L、FeCl₃ 0.002 g/L，pH 7.0， 加入1 g 香豆素，固体培养基加入2%的琼脂粉。

1.1.4 试剂

香豆素，COOLABER科技有限公司；黄曲霉毒素标准品，美国Sigma 公司；黄曲霉毒素试剂盒，北京某公司；PCR 相关试剂，北京某公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离

称取土壤、牛粪等样品各10.0 g，分别加到装有100 mL 无菌水的三角瓶中，放于37 ℃，180 r/min 摇床中30 min。吸取混匀后的溶液1.0 mL 于装有9.0 mL 无菌水的试管中，用漩涡振荡仪混匀，将混匀液逐级稀释至10^-7浓度。

分别吸取各种样品稀释度为10^-5 ～ 10^-7 的溶液100 μL 均匀涂布在NA 培养基平板上，37 ℃培养24 h 后挑选菌落形态各不相同的单菌落划线从而进一步纯化， 培养后观察菌落形态并编号记录，挑选单菌落接种至相应的斜面，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 菌株初筛

挑取保存在斜面上的菌株，分别点接在香豆素培养基上，37 ℃培养，如有菌落长出，则在香豆素培养基上传代3 次，如传代3次仍生长，则记录该菌株编号，进入后续试验。

1.2.3 菌株复筛

制作病原菌平板，待平板凝固后，使用直径为1 cm 的打孔器打孔。将初筛得到的菌株分别接种至NB 培养基，37 ℃摇床培养12 h，以5%接种量转接至发酵培养基，37 ℃培养48 h。取发酵液1.5 mL，10000 r/min 离心10 min，取上清液80 μL 注入病原菌平板的孔中，放在37 ℃的培养箱中培养，观察是否有抑菌圈的出现，并记录抑菌圈的直径。

选择抑菌圈直径较大的菌株接种NB培养基，37 ℃培养12 h 后， 转接到含AFB₁10 μg/mL的发酵培养基中，37 ℃培养3 d。通过酶联免疫试剂盒检测发酵液中剩余的AFB₁ 浓度，并计算AFB₁ 降解率。

1.2.4 菌株的鉴定

1.2.4.1 菌株的形态学鉴定

对菌落大小、菌落颜色、菌落质地、菌落边缘等特征进行鉴别。

1.2.4.2 菌株的分子生物学鉴定

利用PCR技术对菌落16S rDNA 进行扩增，并将纯化的PCR 产物送测序公司进行测序分析。将测序结果用BLAST软件与GenBank 中已登录的16S rRNA 基因序列进行同源性比较，通过CLUSTALX 和BIOEDIT等软件进行多重序列比对分析，并以Neighbor-joining法构建系统发育树（王伟等，2014）。

1.2.4.3 菌株的生理生化试验

根据16S rDNA序列分析的结果，对供试菌株进行生理生化试验，包括硝酸盐还原、厌氧生长、淀粉水解、明胶液化、V-P 测定、D-甘露醇发酵和丙酸盐利用等。

1.2.5 菌株的性质研究

1.2.5.1 菌株的pH 耐受性

制备种子液，按6.0%的接种量接种于pH 分别为3.5、4.5、5.5、6.5的发酵培养基中，37 ℃、180 r/min 摇床培养2 d后，测定菌株的生物量。

1.2.5.2 菌株的温度耐受性

制备种子液，按6.0%的接种量接种于发酵培养基中，分别在17、27、37、47 ℃，180 r/min 摇床培养2 d后，测定菌株的生物量。

2.1 菌株的分离及初筛

共分离得到120株菌，其中45株菌可以在以香豆素为唯一碳源的培养基上生长。

2.2 黄曲霉拮抗试验

病原菌平板扩散法显示初筛获得的45株菌中有20株菌有抑菌圈。将抑菌圈的大小作为抑菌能力强弱的评判标准，通过量取透明圈的直径，共得到拮抗活性较高的菌株11株，如表1所示。

Gonzalez等（2008）报道，玉米青贮前的霉菌含量超过了10⁴ cfu/mL，其中，污染类型以曲霉属为主，这与Keller等（2012）研究青贮饲料样品中霉菌污染情况一致。目前黄曲霉毒素对食品和饲料危害极其严重，然而在去除方法中，物理、化学脱毒的方法存在营养成分流失，脱毒不彻底的缺点。本研究采用微生物法，不仅避免了这些缺点，而且条件温和、安全环保，国内外研究表明微生物脱毒法拥有广阔的开发和应用前景。

由于黄曲霉毒素毒性较大，若直接用于筛选菌株，可能会威胁到人体的健康，而且黄曲霉毒素价格也相对较贵，所以本试验采用与其结构相似的香豆素为唯一碳源进行菌株的初筛。相比而言，香豆素的毒性较低，价格较低廉。李超波等（2012）利用此法筛选到10株能够在香豆素平板上正常生长的降解黄曲霉毒素的菌株，戴军等（2014）利用此法筛选得到27株高效降解毒素的菌株。所以香豆素作为初筛底物来筛选降解黄曲霉毒素的菌株，不仅毒性大大减弱，而且方便准确。

近年来已有利用黑曲霉（李冰等，2012）、枯草芽孢杆菌（孙玲玉，2014）、施氏假单胞菌F4（李超波等，2012）降解黄曲霉毒素的报道，但是降解率大多都集中在85%左右。本研究筛选到的菌株N-1a对黄曲霉毒素的降解率达到95%，优于先前其他研究。本试验菌株N-1a经鉴定为枯草芽孢杆菌，为国家饲料添加剂目录中的安全菌株，并且该菌株还具有对黄曲霉的拮抗活性，应用于青贮时可以达到对黄曲霉毒素防治结合的效果。

品质好的青贮玉米在青贮过程中pH会降低到4.0以下，北方地区进行玉米青贮时，秋季温度会低于20℃，故青贮菌株应具有耐低pH、耐高低温的性质。本试验筛选菌株N-1a在pH3.5及温度为17℃和47℃时生长情况均良好，是一株潜在的微生物青贮菌剂。