１.１ 试验材料

饲料桑粉由湖南省蚕桑科学研究所提供，经实验室检测营养成分含量为：粗蛋白质 ２２.９６％、粗脂肪 ６.２６％、粗纤维 ９.１８％、粗灰分 １３.９０％、钙４.３７％和磷 ０.４６％。添加饲料桑粉的发酵试验组采用全发酵方式（将不同比例的饲料桑粉添加至饲粮中后，对其进行发酵处理），将乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌按 ２∶１∶１ 的比例制成混合菌种，活菌数≥３×１０９ＣＦＵ／ｇ，进行固态发酵处理。发酵设备及试验饲粮由湖南楚沩香农业有限公司提供。

１.２ 试验设计

选取９０头平均体重为３０ｋｇ 左右的宁乡花猪，随机分为５个组，每组３个重复（栏），每个重复 ６ 头猪。对照组饲喂基础饲粮，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组分别饲喂添加９％、１２％、１５％饲料桑粉的全发酵料和 ９％饲料桑粉的未发酵料。试验于２０１６ 年７～９月在湖南宁乡大龙畜牧科技有限公司猪场进行，试验分为２个阶段，中猪阶段（试验期第１～５０ 天）和大猪阶段（试验期第５１～７５天）。饲粮组成及营养水平见表１ 和表２。

１.３ 饲养管理与采样

根据猪场常规程序进行饲养管理。预试期３ ｄ，自由采食、饮水。试验期的第５０天，空腹１２ｈ后，各重复（栏）随机选取 １ 头试验猪进行前腔静脉采集血液（１０ ｍＬ×２），３０００ ｒ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ后收集血清，－２０ ℃冻存待测；试验期第７５天时，各重复（栏）随机选取１头试验猪进行屠宰，采集血液制备血清待测。试验结束后进行屠宰试验，称取０.１ｇ 左右肝脏组织样品，加入９ 倍体积的生理盐水后使用匀浆机制成 １０％的组织匀浆液，再将其在４ ℃下３０００ ｒ／ ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ，取上清液待用；分离肠道，收集回肠食糜，封装在 ５ ｍＬ 塑料离心管内，－８０ ℃ 冻存，用于回肠微生物测定；将十二指肠、空肠、回肠内容物清除干净后，再用生理盐水冲洗肠道，分别剪取各肠段２ｃｍ 置于甲醛固定液中，用于肠道组织形态测定。

１.４ 测定指标及方法

１.４.１ 血清抗氧化指标

测定 ２ 个阶段（第 ５０ 天和第 ７５ 天）血清中丙二醛（ＭＤＡ）含量、总超氧化物歧化酶（Ｔ⁃ＳＯＤ）和谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ⁃Ｐｘ）活性以及总抗氧化能力（Ｔ⁃ＡＯＣ）。测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，并按照试剂盒说明书进行指标测定。

１.４.２ 肝脏抗氧化指标

测定肝脏中 ＭＤＡ 含量、Ｔ⁃ＳＯＤ 和 ＧＳＨ⁃Ｐｘ 活性以及 Ｔ⁃ＡＯＣ。测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，并按照试剂盒说明书进行指标测定。

１.４.３ 肠道组织形态

制作肠道组织切片，观察肠道组织结构，具体测量十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度与隐窝深度比（Ｖ／ Ｃ）。

１.４.４ 肠道菌群

利用粪便基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），按试剂盒说明书提取试验猪回肠食糜 ＤＮＡ。对 ＤＮＡ 样品进行检测，检测合格的样品构建文库委托华大基因完成，内容包括：回收目的 Ａｍｐｌｉｃｏｎ 片段，用 Ｔ４ ＤＮＡ 聚合酶、Ｋｌｅ⁃ｎｏｗ ＤＮＡ 聚合酶和 Ｔ４ 多核苷酸激酶（ＰＮＫ）将打断形成的黏性末端修复成平末端，再通过 ３′端加碱基“Ａ”，使得 ＤＮＡ 片段能与 ３′端带有“Ｔ”碱基的特殊接头连接；或者设计合成含有测序接头的双 Ｉｎｄｅｘ 融合引物，以基因组 ＤＮＡ 为模板，进行融合引物 ＰＣＲ，磁珠筛选目的 Ａｍｐｌｉｃｏｎ 片段，最后，用合格的文库进行 ｃｌｕｓｔｅｒ 制备和测序。数据经过数据过滤，滤除低质量的 ｒｅａｄｓ，剩余高质量的ｃｌｅａｎ ｄａｔａ 方可用于后期分析；通过 ｒｅａｄｓ 之间的ｏｖｅｒｌａｐ关系将 ｒｅａｄｓ 拼接成 Ｔａｇｓ；在给定的相似度下将 Ｔａｇｓ 聚成操作分类单位（ＯＴＵ），然后通过ＯＴＵ 与数据库比对，对 ＯＴＵ 进行物种注释；基于ＯＴＵ 和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。

１.５ 数据处理与统计分析

采用 Ｅｘｃｅｌ ２００７ 和ＳＰＳＳ ２０.０ 软件对数据进行整理，数据以平均值±标准差表示，所有组间进行方差分析，添加 ９％饲料桑粉全发酵料组与添加９％饲料桑粉未发酵料组进行 ｔ 检验，以 Ｐ＜０.０５ 作为差异显著性判断标准。

３.１ 发酵饲料桑粉对宁乡花猪机体抗氧化性能的影响

由于宁乡花猪特有的生理特点，其体脂含量相对较高，性质活泼的自由基可诱发体内不饱和脂肪酸的氧化，产生脂质过氧化反应，从而降低宁乡花猪肉品质。血清及肝脏中 ＭＤＡ 含量、Ｔ⁃ＳＯＤ和 ＧＳＨ⁃Ｐｘ 活性以及 Ｔ⁃ＡＯＣ 反映了动物机体抗氧化防御系统的水平 。ＭＤＡ 是动物机体由于自由基的氧化作用产生过氧化脂质后分解代谢的产物，其含量越高说明动物机体产生的过氧化脂质越多，机体氧化损伤越严重；Ｔ⁃ＳＯＤ 是被称为动物机体抗氧化系统的第 １ 道防线，可催化机体内超氧阴离子自由基（Ｏ２－•）生成过氧化氢（Ｈ２Ｏ２），Ｈ２Ｏ２进 而 与 过 氧 化 氢 酶 （ ＣＡＴ） 反 应 生 成 水（Ｈ２Ｏ）和氧气（Ｏ２ ），是机体清除自由基的首要物质；ＧＳＨ⁃Ｐｘ 是动物机体内一种具有催化过氧化物分解的酶，可以特异性的催化还原谷胱甘肽，从而使得谷胱甘肽与动物机体内的氢过氧化物发生还原反应，降低机体氧化损伤；Ｔ⁃ＡＯＣ 是动物机体抗氧化系统功能状态的一个综合性指标，反映了动物机体抗氧化系统的总体水平。章丹丹等研究发现，在桑枝中提取的黄酮化合物在细胞试验和体外化学试验汇总均具有抗氧化活性，有很强的自由基清除能力。周林从桑枝中分离提纯出黄酮类化合物，通过体外模拟试验同样证明桑枝中黄酮类化合物具有抗氧化活性。本试验研究发现利用饲料桑粉饲喂宁乡花猪可有效提高其血清中Ｔ⁃ＡＯＣ，且添加 １５％ 饲料桑粉全发酵料组血清Ｔ⁃ＡＯＣ显著高于对照组，这与黄静等利用桑叶粉饲喂胡须鸡研究结果相似，这可能与饲料桑粉中所含的黄酮类具有的抗氧化活性有关。陈玲玲等研究桑叶黄酮对糖尿病小鼠的影响中发现，桑叶黄酮可有效提高小鼠肝脏中超氧化物歧化酶活性，降低肝脏中 ＭＤＡ 含量。本试验研究发现，饲料桑粉添加组宁乡花猪肝脏 ＭＤＡ 含量相比对照组有降低的趋势，肝脏中 Ｔ⁃ＳＯＤ、ＧＳＨ⁃Ｐｘ 活性和 Ｔ⁃ＡＯＣ 相比对照组均有所提高，说明饲料桑粉可以有效提高宁乡花猪机体抗氧化水平，进而改善肉品质。

３.２ 发酵饲料桑粉对宁乡花猪肠道组织形态的影响

小肠是动物机体消化吸收营养物质的主要部位，绒毛高度、隐窝深度及 Ｖ／ Ｃ 值是反映小肠消化吸收功能的重要指标。小肠黏膜上有大量肠绒毛，绒毛高度越高则小肠对营养物质的吸收面积越大，消化吸收功能越强，绒毛萎缩引起绒毛高度的降低将导致小肠吸收功能的下降；隐窝深度的高低反映了肠上皮细胞的生成率，肠道隐窝的细胞不断的向绒毛处分化，替代补充脱落或损伤的绒毛细胞，隐窝处细胞生成率下降将使隐窝深度变浅，表明绒毛细胞成熟率上升，小肠营养吸收功能增强。有研究表明，隐窝深度还反映了肠上皮细胞的迁移率，隐窝深度降低则表明动物肠上皮细胞的迁移率降低，动物肠上皮细胞的迁移率降低可以减少能量损失，从而有利于促进动物生产性能。小肠 Ｖ／ Ｃ 值可以比较直观地反映小肠的消化吸收能力，Ｖ／ Ｃ 值越高则代表小肠消化吸收能力越强。本试验研究发现，饲料桑粉添加组宁乡花猪空肠绒毛高度及 Ｖ／ Ｃ 值相比对照组有所下降，这可能与饲料桑粉中所含的单宁及植物凝集素等抗营养因子损伤肠道上皮细胞有关，具体原因有待进一步研究；添加 ９％饲料桑粉全发酵料组相比添加 ９％饲料桑粉未发酵料组宁乡花猪空肠和回肠 Ｖ／ Ｃ 值显著提高，且在本课题组前期试验结果表明添加 ９％饲料桑粉全发酵料对宁乡花猪生长性能有一定的改善作用，说明发酵工艺可通过降低或清除饲料桑粉中的抗营养因子，从而降低饲料桑粉对宁乡花猪肠道的损伤，进而有益于其生产性能。

３.３ 发酵饲料桑粉对宁乡花猪肠道菌群的影响

动物肠道菌群的稳态与宿主的肠道健康状况及生产性能密切相关，肠道菌群的变化也可直接影响 动 物 肠 道 对 营 养 物 质 的 吸 收 代 谢。Ｌａｍｅｎｄｅｌｌａ等研究表明，猪肠道内的微生物中的厚壁菌门和拟杆菌门与机体对碳水化合物的代谢有一定相关。 本试验研究发现，门水平上，厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门这 ３ 种门类的微生物占回肠菌群的 ９５％以上；所有宁乡花猪回肠菌群共产生 ２５７ 个 ＯＴＵ，肠道菌群相对丰度越高则越有利于维持动物肠道菌群的稳态，进而促进动物生产性能。 吕月琴等和舒刚等利用发酵饲料分别在蛋鸡和肉鸡饲养试验中发现，饲喂发酵饲料组相比未发酵饲料组，动物肠道中的乳酸菌等益生菌数量显著提高，大肠杆菌数量有效降低。Ｃａｎｉｂｅ 等利用发酵饲料和未发酵饲料饲喂生长试验发现，发酵饲料可有效提高动物肠道有益菌数量，有利于促进动物肠道菌群的稳态并提高菌群丰度。 本试验研究表明，全发酵料组宁乡花猪回肠菌群 Ａｌｐｈａ 多样性指数相比未发酵料组，ＯＴＵ 和 Ｃｈａｏ 指数有所提高，且各全发酵料组相比未发酵料组乳杆菌种的相对丰度更高，这可能与添加饲料桑粉饲粮经发酵处理后，饲粮 ｐＨ 降低，饲喂宁乡花猪后在肠道中提供了一个适合乳酸菌等喜酸益生菌种的大量繁殖的环境有关，此结果与邝哲师等利用发酵桑叶粉饲喂胡须鸡试验结果相似，具体原因有待进一步研究。