铬是人体必需的微量营养元素之一， 是人体内葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF）的有效活性成分。有机铬是一类生物效价高的铬源， 可以更显著地促进动物生长，改善胴体品质和繁殖性能等。铬进入动物机体后经肠道吸收，在血液里与运送铁的球蛋白结合，而后被运至肝脏及全身。由于不同形式的铬在组织中的结合程度不同，导致吸收率不同，因此铬的吸收与化学结合形式有很大关系，无机铬不但毒性大，且以极低水平吸收，吸收率约为0.4％~3.0％；有机铬较无机铬易被吸收，吸收率为10％~25％，其有效性约为无机铬的10 倍以上。所以有机铬是一种较有应用前景的铬补充物。

在有机铬制剂中， 高铬酵母是通过微生物发酵方法制备的，具有生物活性高、毒性小、生产成本低等特点，并且还能同时补充一定量的氨基酸， 可以认为是一种具有较好应用前景的有机铬补充物，用于防治疾病和作为饲料添加剂有着广阔的应用前景。该试验研究了1株产朊假丝酵母对无机铬的富集及其影响因素，并对其发酵条件进行了优化，旨在为铬酵母的工业化生产提供基础依据。

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

高生物量菌株产朊假丝酵母Candida utilisA7， 由山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏中心保存。

1.1.2 试剂

重铬酸钾（分析纯）、二苯氨基脲、三氯化铬（分析纯）、乙醇、高锰酸钾、硫酸、高氯酸、盐酸。

1.1.3 试验设备

水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、高速离心机、电热板、UV2000 紫外分光光度计。

1.1.4 培养基配方

斜面培养基配方为酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、KH₂PO₄ 2 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。液体种子培养基：酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、KH₂PO₄ 2 g、蒸馏水1 000 mL。

发酵培养基：同液体种子培养基。

1.2 试验方法

比较不同铬添加量、接种量、培养温度、装液量、发酵初始pH 值、培养时间对富铬酵母生物量及铬含量的影响， 确定试验用酵母菌株富集无机铬的最佳发酵条件。

1.2.1 培养基中铬离子浓度的确定

在液体发酵培养基中添加不同浓度的三氯化铬，使Cr³⁺浓度分别为0、40、60、80、100、120、150 μg/mL（m/V），培养基初始pH 值5.0，121 ℃灭菌30 min，当温度降至30 ℃时接种，接种量为4％（V/V），每500 mL 三角瓶装液量为50 mL，于30 ℃，200 r/min 摇床培养20 h 结束，测定酵母的生物量和酵母细胞中有机铬的含量，考察培养基中铬离子浓度对酵母富集铬的影响。

1.2.2 接种量的确定

选取温度30 ℃，培养基中添加三氯化铬至Cr³⁺浓度100 μg/mL （m/V）， 分别按2%、4%、6%、8%、10%（V/V）接种量接种，摇床转速200 r/min，培养时间20 h，做不同接种量的单因素试验，测定生物量及有机铬的含量，考察接种量对酵母富集铬的影响。

1.2.3 最适培养温度的确定

培养基中添加三氯化铬至Cr³⁺浓度100 μg/mL（m/V），在其他培养条件相同的情况下，分别在26、28、30、32 ℃下培养该酵母菌20 h， 测定生物量及酵母细胞中有机铬的含量， 考察不同培养温度对酵母富集铬的影响。

1.2.4 装液量（通气量）对酵母富集铬的影响试验

每500 mL三角瓶装液量分别为25、50、75、100、125 mL，培养基中添加三氯化铬至Cr³⁺浓度20 μg/mL（m/V），初始pH 值为5.0，接种量4％（V/V），培养20 h，测定生物量及酵母细胞中有机铬的含量，考察不同装液量对酵母富集铬的影响。

1.2.5 发酵培养基初始pH 值的确定

采用液体发酵培养基，培养基中添加三氯化铬至Cr³⁺浓度100 μg/mL（m/V），初始pH 值分别调为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5， 每500mL 三角瓶装液量在50 mL，接种量4％（V/V），培养20 h，测定其生物量和酵母细胞内有机铬的含量， 考察发酵培养基不同初始pH 值对酵母富集铬的影响。

1.2.6 发酵时间的确定

为确定不同培养时间对酵母生物量及铬含量的影响，采用产朊假丝酵母菌株、实验室7 L 机械搅拌发酵罐进行。发酵罐装量为5 L，采用上述发酵培养基，发酵温度30 ℃，4％（V/V）接种量，发酵培养基初始pH值为5.0，培养基中加入Cr³⁺浓度100 μg/mL（m/V）的三氯化铬。试验中每4 h 取样1 次，测定生物量和酵母中有机铬的含量，绘制富铬酵母生长曲线及铬富集曲线，以确定适宜的发酵时间。

1.2.7 发酵工艺稳定性研究

为了验证上述试验得出的最佳发酵工艺的稳定性（试验结果的重现性），分别采用上述试验所得最佳发酵工艺进行了5 个批次的发酵试验， 测定生物量和酵母中有机铬的含量， 计算变异系数以验证发酵工艺的稳定性。

1.3 分析检测

1.3.1 生物量的测定

将发酵液3 500 g 离心10 min，收集酵母菌体，蒸馏水洗涤3 次，除去培养基中无机铬及其他成分，收集菌体，冷冻干燥后称重即得（g/100 mL，m/V）。

1.3.2 富铬酵母中有机铬的测定

二苯氨基脲法。

1.3.2.1 原理

在酸性条件下， 样品中全部铬离子氧化成Cr⁶⁺，而在微酸性条件下，Cr⁶⁺可与二苯氨基脲（DPC）结合生成一种紫红色络合物，其最大吸收波长为540 nm，溶液颜色的深浅与生成物浓度成正比，即与Cr⁶⁺浓度成正比，铬量在0~25 μg/mL 范围内符合比耳定律。

1.3.2.2 有机铬含量的测定

采用透析处理法使铬酵母中的无机铬和有机铬得以分离，并对透析内液进行消化测定，便可测得铬酵母中有机铬的含量。

透析： 将新鲜的富铬酵母置于pH 值8.6 的Tris-HCl-甘油缓冲液中，加入二氧化硅进行研磨。在电子显微镜下观察，待酵母细胞完全破碎后，装入事先处理好的透析袋内，扎紧上端，于蒸馏水中透析，期间不断换水，并检测透析外液中的铬含量，直到透析外液中检测不出铬时停止透析。

消化： 取上述透析袋内液适量于100 mL 三角瓶中，加10 mL 硝酸，三角瓶顶部放小漏斗，在电热板上微火加热至发烟，稍冷却后，加入3 mL 高氯酸继续加热，当溶液变为清亮无色并冒浓白烟时停止加热，冷却后，加入5 mL 6 mol/L浓盐酸，继续消化至冒白烟时（剩余体积2 mL 左右，切不可蒸干）结束，消化后有机铬可被完全氧化成Cr⁶⁺。

标准曲线的绘制：取15 mL 具塞刻度试管6 支，分别加入铬标准工作液（ 铬浓度1.0 μg/mL，m/V）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别加入1∶9 H₂SO₄ 5 mL，加入蒸馏水15 mL，加0.1 g/L 过硫酸铵溶液2 mL，加1 mg/mL 的硝酸银溶液3 滴，混匀后，放入60 ℃水中，加热至沸，保持25 min。冷却后，加入5 mL 3 mol/L 氢氧化钠溶液（pH 值1.5~2.0），摇匀，定容至25 mL，冷却后，加入二苯氨基脲1.5 mL，摇匀，15 min 后测A540，绘制标准曲线。

测定方法：取消化处理后的样品液适量，按标准曲线方法测定，并计算样品中铬的含量。

2.1 培养基中铬离子浓度对酵母富集铬的影响在4%接种量时，随着培养基中Cr³⁺浓度的提高，富铬酵母中有机铬含量也会进一步提高，当达到100.0 μg/mL 时，出现了一个高峰值（见图1）。但当培养基中Cr³⁺的浓度过高时，由于铬元素的毒性作用，明显抑制了酵母的生长和代谢，同化铬到菌体内的代谢作用也受到了抑制。当发酵液中Cr³⁺的浓度超过100.0 μg/mL 时，酵母细胞的生长受到明显抑制，表现为细胞体积变小，细胞分裂迟缓，生物量下降。该试验结果表明，当培养基中加入Cr³⁺浓度在100.0 μg/mL 时为好。

2.2 接种量对酵母富集铬的影响试验从图2 可以看出，随着接种量的增加， 富铬酵母的生物量及有机铬的含量先增加后下降，生物量以接种量4%最高，而酵母细胞内铬含量以接种量6%最高，经比较总富铬效果后确定其最适接种量为4%~6%。

2.3 不同培养温度试验由图3 可以看出， 在26~32 ℃范围内， 发酵温度对富铬酵母的生物量以及酵母细胞内有机铬的含量均有一定影响。富铬酵母在30 ℃发酵时，酵母生

物量最大，细胞内有机铬含量也最高，说明30 ℃最有利于产朊假丝酵母A7 对Cr³⁺的富集。

2.4 装液量（通气量）试验由图4 可以看出，装液量对富铬酵母的生长和富铬能力有一定影响，试验中500 mL 三角瓶装液量50~75 mL 范围内酵母细胞生物量和富铬量均较高，随着装液量的增加，生物量和铬含量都明显下降。可见适当减少装液量以增加通气量并能提高富铬酵母的生物量和富铬量，据此推断，在发酵罐生产中可以适当加大通气量以促进富铬酵母生长和对铬的吸收。

2.5 发酵培养基初始pH 值对生物量和酵母细胞内铬含量的影响由图5 可以看出， 初始pH 值对富铬酵母的生长和富铬能力有较大影响。当初始pH 值为5.0 时生物量及细胞内有机铬的含量均达到最高。因此，初始pH 值应控制在5.0 为宜。

2.6 培养时间的确定由图6 可以看出， 发酵罐生产富铬酵母， 酵母细胞中有机铬的含量在发酵初期生物量很低的情况下就达到较高的水平， 说明酵母对铬的富集是随着酵母的生长而同步进行的，有机铬的含量在发酵16 h 达到最高，为2 210 μg/g，而其生物量在20 h 达到最大。综合来看，在20 h 铬的富集量达到最大，故发酵时间以20 h 为宜。

2.7 最优方案下制备的酵母测试结果最优工艺下制备的酵母生物量和有机铬含量试验结果见表1。

通过以上试验得出富铬酵母的最适发酵条件： 每500 mL

摇瓶装量50 mL，温度30 ℃，接种量4%~6％，发酵培养基最适初始Cr³⁺浓度为100 μg/mL，初始pH 值为5.0，发酵时间为20 h。对最优工艺条件下制备的富铬酵母5 个批次的生物量、有机铬含量及其变异系数来看，培养过程波动不大，基本稳定，说明该工艺切实可行。

①产朊假丝酵母（Candida utilis）是卫生部规定可用于保健食品的2 种酵母类菌种之一，在酵母类真菌中较之啤酒酵母在生物量方面具有明显优势， 故选择产朊假丝酵母作为试验用菌株。

②该试验结果证实，产朊假丝酵母A7 菌株对铬有相当的生物转化能力， 但其对铬的富集能力并不随培养基中Cr³⁺浓度的升高而一直升高， 而是有一个最佳浓度。在100μg/mL 时，富集效果最好。低于100 μg/mL 时，随着Cr³⁺浓度的增加，产朊假丝酵母A7 对铬的富集量也逐渐提高，但当Cr³⁺浓度超过100 μg/mL 时， 则铬的富集效果增加不明显，且酵母的正常生长受到抑制作用。因而在工业化生产富铬酵母时建议选择在培养基中添加100 μg/mL Cr³⁺，发酵培养20 h 为宜。

据刘静等研究推测， 铬的富集可能与细胞膜表面的特殊蛋白载体有关，在低铬浓度时，载体的运载能力大于细胞所能接触到的铬， 这时提高培养基中的铬浓度可以提高富集效果；而当铬浓度较高时，铬离子相对过剩，铬离子之间与载体竞争性结合而产生抑制， 反而使蛋白载体对铬的运载能力下降。因此，富铬酵母培养中铬的添加量至关重要。这与该试验结果基本一致。

③通过对产朊假丝酵母培养条件的研究发现，培养基中Cr³⁺添加浓度、接种量、发酵液的初始pH 值、温度、转速、时间都对富铬酵母的生物量和富铬能力有很大影响。

该试验制备富铬酵母的最佳工艺条件为培养温度30 ℃、培养基铬添加量100 μg/mL（m/V）、接种量体积分数为4%~6%（V/V）、培养起始pH 值为5.0、培养时间20 h。在该优化条件下获得的富铬酵母生物量可达到1.83g/100 mL， 有机铬含量可达2210 μg/g。利用产朊假丝酵母制备富铬酵母工艺条件的初步优化结果为发酵罐放大生产奠定了基础。