随着全球经济的蓬勃发展和人们生活水平的不断提高，人类对于畜产品的需求量逐年增大，从而促使畜牧业在规模与质量上不断发展。在全球人口日益增多的背景下，如何利用生物技术方法开发新型饲料资源并提高动物对原有饲料原料利用率成为解决不断增长的畜产品需求量和日益紧缩的耕地面积之间矛盾的有效途径之一。

研究表明，饲料经益生菌发酵后，菌种产生的多种代谢产物不仅能够提高饲料原料中蛋白质、脂肪和糖类等成分的营养转化率，同时能够降解常用饲料原料中的抗营养因子等有害成分，扩大饲料原料的使用范围，提高原有饲料的营养价值。另外，发酵饲料能够改善饲料适口性，调节动物肠道的微生态平衡，提高了畜禽产品的食品安全性。目前，应用于微生物发酵饲料的菌种类型主要有酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、曲霉等。其中，酵母菌是单细胞真核微生物的一种，能够发酵糖类物质，其本身含有丰富的氨基酸、维生素、酶类等物质，是直接食用最多的一种微生物，在畜牧业生产中已有广泛的应用。本研究分别采用酿酒酵母、热带假丝酵母和马克思克鲁维酵母对５种常用饲料原料小麦、玉米、豌豆、大豆和豆粕进行发酵处理，对发酵前后的营养指标和抗营养因子含量进行比较测定，为发酵原料在饲料工业中的应用提供理论基础和技术支撑。

１ 材料与方法

１.１ 试验材料

１.１.１ 菌种　

热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）和酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。马克思克鲁维酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ）由淮阴师范学院生命科学学院张瞳老师馈赠。

１.１.２ 原料及处理　

 发酵原料为市售小麦、玉米、豌豆、大豆和豆粕。将原料除杂后进行粉碎，过４０目筛，作为酵母菌发酵基础料。

１.１.３  培养基配制　

１号试剂：酵母膏１０ｇ，蛋白胨２０ｇ，琼脂粉２０ｇ（液体培养基不加），蒸馏水９００ｍＬ；２号试剂：葡萄糖２０ｇ，蒸馏水１００ｍＬ。将１号试剂瓶和２号试剂瓶分别配制灭菌，待温度冷却至６０～７０℃后混合均匀。

１.１.４ 试验地点及时间　

试验地点为淮阴师范学院生命科学学院，试验时间为２０１８年３—５月。

１.２ 试验方法

１.２.１ 菌的活化及扩大培养　

将酵母菌冻干粉瓶打碎后，用液体培养基溶解，吸取１００μＬ接种至固体培养基表面，均匀涂布，３０℃培养２４～４８ｈ后，选择菌落生长良好的培养皿，相同条件下进行划线培养，挑取单菌落，装入液体培养基中震荡培养，菌悬液混合均匀后按照１∶５０接种量扩大培养，测定菌液Ｄ值，制备接种菌液。

１.２.２发酵　

每种原料称取２００ｇ，１１０℃加热７ｍｉｎ，各种酵母的接种量均为１.０×107ｃｆｕ／ｇ，原料与水分比例为１∶１。混合均匀后，装入发酵袋中排空空气静置发酵，发酵温度为３０℃，发酵时间为２４、４８、７２、９６ｈ。每隔１２ｈ检查１次将袋中气体排空，发酵完毕后样品置于－２０℃冰箱里待测。

１.３ 指标测定

１.３.１ ｐＨ值的测定　

取每株菌发酵的各时间段的每种发酵原料样品５ｇ于小烧杯中，加入４５ｍＬ蒸馏水，每隔５ｍｉｎ搅拌１次，共搅拌３次，静置１０ｍｉｎ后，ｐＨ计测量。

１.３.２  干物质回收率的测定

干物质测定方法参照ＧＢ／Ｔ８３０３—２０１３《茶　磨碎试样的制备及其干物质含量测定》，计算公式：干物质回收率＝（发酵原料干物质质量／发酵原料质量）／（原料干物质质量／原料质量）×１００％。

１.３.３ 还原糖含量的测定　

参照王俊刚等的３，５－二硝基水杨酸法测定。准确称取２.０ｇ样品于１００ｍＬ三角瓶中，加入约５０ｍＬ蒸馏水，于５０℃恒温水浴中保温２０ｍｉｎ，期间不时搅拌使还原糖浸出。静止三角瓶使样品沉淀，吸取上清液８ｍＬ于离心管中，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，将上清液转移至新离心管中，此即为还原糖测定样品。还原糖含量以ｍｇ／ｇ计算。

１.３.４ 粗蛋白含量的测定　

依据ＧＢ／Ｔ６４３２—１９９４《饲料中粗蛋白测定方法》凯式定氮法进行测定。称取０.３ｇ左右测定干物质时烘干至恒重的样品，加入催化剂和硫酸，进行消化，直至溶液透明呈蓝绿色，待其冷却，应用自动凯氏定氮仪测定其含氮量。

１.３.５ 植酸含量测定方法　

采用分光光度法测定植酸含量。步骤大致如下：（１）称取０.５ｇ样品，加入６ｍＬ１.８ｍｏｌ／ＬＨＣｌ，３５℃水浴２ｈ，期间不断振荡，水浴后静置过夜；（２）样品４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液，加入０.４ｍＬ铁试剂，沸水浴４５ｍｉｎ后再次离心，弃上清液；（３）用３ｍＬ１.５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ对沉淀进行溶解，再次离心，弃上清液；（４）加入１ｍＬ３.２ｍｏｌ／Ｌ硝酸溶解沉淀后，依次加入０.２ｍＬ９％的柠檬酸三钠、０.２ｍＬ１％对苯二酚、０.４ｍＬ０.４％邻菲罗啉，纯水定容至５０ｍＬ，ｐＨ值调节至３～４；（５）３５℃水浴２ｈ后自然冷却，于５１０ｎｍ波长处测定吸光度。计算公式：植酸含量＝Ｄ５１０ｎｍ×８.４２÷样品质量（ｍｇ）×１.２５×１００％。

１.３.６ 抗性淀粉含量的测定

参照高鑫（２０１２）的方法。步骤大致如下：（１）准确称取０.２ｇ样品于带塞玻璃试管中，加入蒸馏水０.４ｍＬ，沸水浴２０ｍｉｎ后冷却至室温；（２）加入ＨＣｌ－ＫＣｌ缓冲溶液（ｐＨ值为２.０）２.５ｍＬ和１０％胃蛋白酶１０５μＬ，３７℃恒温振荡１ｈ；（３）加入４ｍＬ的醋酸钠缓冲液（ｐＨ值＝６.９）和淀粉酶－糖化酶混合溶液４ｍＬ，３７℃振荡１６ｈ；（４）４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，去掉上清液，５０％乙醇溶液洗涤沉淀，重复２次；（５）依次加入２ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＫＯＨ溶液，８ｍＬ醋酸钠缓冲液（ｐＨ值为３.８），１００μＬ糖化酶溶液，６０℃水浴１ｈ；（６）冷却至室温，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，保留上清液；（７）根据“１.３.３”节还原糖测定方法测定上清液中的还原糖含量。计算公式：抗性淀粉含量＝还原糖含量×０.９。

１.４ 数据处理

统计学分析采用ＳＰＳＳ１７.０（ＳＰＳＳＩｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）软件的Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ进行统计分析，计算结果以“平均值±标准误”表示。Ｐ＜０.０５表示差异显著。

２　结果与分析

２.１ 不同饲料原料经３种酵母菌发酵后ｐＨ值的变化规律

由图１可知，小麦和玉米分别经３种酵母发酵２４ｈ后ｐＨ值均显著降低（Ｐ＜０.０５），且于４８～９６ｈ内趋于稳定水平，呈明显的酸性。豌豆和豆粕分别经酿酒酵母和热带假丝酵母发酵２４ｈ后ｐＨ值均显著降低（Ｐ＜０.０５），但随后于７２ｈ后逐渐恢复至初始ｐＨ值。大豆原料经３种酵母发酵７２ｈ后ｐＨ值均显著升高（Ｐ＜０.０５），呈明显碱性。

２.２ 不同饲料原料经３种酵母菌发酵后干物质回收率的变化规律

由图２可知，小麦原料经３种酵母发酵７２ｈ后干物质回收率显著降低（Ｐ＜０.０５），玉米原料经酿酒酵母发酵后干物质回收率呈现先降低后升高的趋势，而经热带假丝酵母和马克斯克鲁维酵母发酵７２ｈ和９６ｈ后干物质回收率则显著降低（Ｐ＜０.０５）。豌豆经酿酒酵母和热带假丝酵母发酵９６ｈ后干物质回收率显著降低，但不受马克斯克鲁维酵母发酵影响（Ｐ＞０.０５）。大豆分别经热带假丝酵母和马克斯克鲁维酵母发酵７２ｈ和４８ｈ后干物质回收率显著降低（Ｐ＜０.０５），豆粕原料分别经酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母发酵７２ｈ后干物质回收率显著降低（Ｐ＜０.０５），而经热带假丝酵母发酵７２ｈ后干物质回收率却显著上升（Ｐ＜０.０５）。

２.３ 不同饲料原料经３种酵母菌发酵后还原糖含量的变化规律

由图３可知，玉米原料分别经酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母发酵２４ｈ后还原糖含量显著下降（Ｐ＜０.０５），而大豆、豌豆和豆粕原料经２种酵母发酵后还原糖含量均表现出先升高后降低的规律。豌豆原料经热带假丝酵母发酵２４ｈ后还原糖含量显著降低（Ｐ＜０.０５），而其他原料均表现出先升高后降低的规律。

２.４ 不同饲料原料经３种酵母菌发酵后粗蛋白含量的变化规律

由图４可知，酿酒酵母发酵豆粕原料９６ｈ时粗蛋白含量显著降低（Ｐ＜０.０５），而发酵其他４种饲料原料对蛋白含量无显著影响（Ｐ＞０.０５）。热带假丝酵母发酵小麦、玉米、大豆和豆粕４种原料７２～９６ｈ内粗蛋白含量均出现显著升高现象（Ｐ＜０.０５）。马克斯克鲁维酵母发酵玉米２４ｈ时，粗蛋白含量显著升高（Ｐ＜０.０５），但随后降低至初始水平，而发酵豆粕原料７２ｈ后粗蛋白含量显著升高（Ｐ＜０.０５）。

２.５ 不同饲料原料经３种酵母菌发酵后植酸含量的变化规律

由图５可知，酿酒酵母发酵２４ｈ后，大豆、豆粕、小麦植酸含量显著降低（Ｐ＜０.０５）；豌豆发酵７２ｈ后，植酸含量的去除率达到４９．３％（Ｐ＜０.０５）；玉米的植酸含量在发酵４８ｈ内无显著变化（Ｐ＞０.０５）。热带假丝酵母发酵２４ｈ时，大豆、豌豆、小麦植酸含量显著降低（Ｐ＜０.０５）；发酵４８ｈ之后豆粕植酸含量的去除率达到５５．３％（Ｐ＜０.０５），玉米的植酸含量无显著变化（Ｐ＞０.０５）。马克思克鲁维酵母发酵２４ｈ后，大豆、豆粕、小麦植酸含量显著降低（Ｐ＜０.０５），玉米与豌豆发酵４８ｈ后植酸含量显著降低（Ｐ＜０.０５）。马克思克鲁维酵母对大豆植酸含量降低效果最为显著，对其植酸去除率达到６８.１％。

２.６ 不同饲料原料经３种酵母菌发酵后抗性淀粉含量的变化规律

由图６可知，酿酒酵母发酵４８ｈ后，小麦原料的抗性淀粉含量显著降低（Ｐ＜０.０５），而豌豆和玉米则在发酵７２ｈ抗性淀粉含量显著降低（Ｐ＜０.０５）。豌豆和小麦经热带假丝酵母发酵２４ｈ后抗性淀粉含量显著降低（Ｐ＜0.０５）。马克思克鲁维酵母发酵４８ｈ后豌豆抗性淀粉含量降低４４％（Ｐ＜０.０５）；发酵７２ｈ后，小麦与玉米抗性淀粉含量分别降低了４３％和５２％（Ｐ＜０.０５）；大豆和豆粕则在发酵过程中抗性淀粉含量无显著变化（Ｐ＞０.０５）。

３ 讨论

ｐＨ值是生物发酵工艺中的一个非常重要的参数，饲料原料发酵过程中ｐＨ值降低主要归结于发酵菌种增殖过程中产生并积累的有机酸，微生物发酵饲料中酸含量的增加反过来有利于饲料的长期保存。本试验中，小麦和玉米原料经酿酒酵母、热带假丝酵母和马克斯克鲁维酵母发酵后ｐＨ值均呈现显著下降趋势。研究发现，酵母菌本身产酸能力并不强，在发酵过程中可将葡萄糖代谢产物———丙酮酸转化为乳酸、乙酸或乙醇，这可能是诱发原料ｐＨ值在发酵初期降低的因素之一。随着发酵后期乙醇的积累，酵母细胞的生长受到抑制，丙酮酸代谢产酸途径被切断，因此ｐＨ值无法持续降低。也有研究人员认为，原料本身未被灭菌的乳酸菌在发酵过程中得到一定程度的增殖，且酵母菌增殖过程中产生的丙酮酸、琥珀酸等代谢产物能够刺激乳酸菌的活动，为其提供营养物质，因而诱导原料ｐＨ值的迅速降低。本试验还发现大豆在酵母菌发酵后期ｐＨ值逐渐升高，说明蛋白类原料和淀粉类原料被酵母菌发酵的效果存在较大差异。作者推测这种差异可能归结于酵母菌在不同发酵底物下积累的代谢产物不同所导致，在本试验发酵过程中发现，大豆发酵后期出现腥味，可能是挥发性氨类和硫化物。刘倚帆等报道，酵母菌和米曲霉协同发酵整粒菜籽后期ｐＨ值也出现一定程度的升高。因此，全脂大豆或菜籽中较高含量的蛋白质以及脂肪可能是酵母菌发酵后期ｐＨ升高的主要因素。本研究中豆粕和豌豆在３种不同酵母菌发酵下ｐＨ值呈现不同的变化规律也说明不同酵母菌在单一发酵底物下的代谢方式和途径存在一定差异。

Ｔｅｒｅｂｉｚｎｉｋ等认为益生菌固态发酵过程中干物质损失量和生物量呈正相关。这一点在马克斯克鲁维酵母发酵中尤为明显，酵母菌分解利用发酵底物中的物质合成自身成分，并释放出代谢产物，在这一过程中，干物质量在发酵后期呈现明显的下降趋势。但本试验也发现，热带假丝酵母发酵豆粕后期干物质回收率出现升高趋势，说明发酵物料中的生物量增长速度超过了发酵底料的消耗速度，笔者推测这种现象可能只是短暂出现，随着发酵的继续进行，发酵底物的消耗速度势必会超过生物量的增长。

酵母菌最重要的营养物质和能量来源大部分来自于单糖，而发酵纤维素等多糖的能力有限，这一点与枯草芽孢杆菌不同。大量研究报道，在果酒、泡菜等酿造发酵过程中，酵母菌能够迅速降解底物中已有的还原糖成分，将其转化为酸类、酯类或醇类物质。本研究结果发现，玉米分别经酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母发酵后还原糖含量持续下降，而大豆、豌豆和豆粕原料经２种酵母发酵后还原糖含量均表现出先升高后降低的规律。豌豆经热带假丝酵母发酵后还原糖含量持续降低，而其他原料均表现出先升高后降低的规律。由此说明，不同酵母菌作用于不同饲料原料底物，产生能够分解多糖的酶的性质不同，后期当淀粉等多糖经酵母菌酶解成为还原糖后反过来又促进了酵母菌的增殖。

本研究结果表明，热带假丝酵母发酵小麦、玉米、大豆和豆粕４种原料可提高原料的粗蛋白水平，这一点优于酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母。研究报道，生产上利用淀粉、葡萄糖、玉米深加工副产物等作为热带假丝酵母、酿酒酵母大量培养的底物，酵母本身蛋白质含量为４５％～６０％，其大量增殖的同时提高了发酵底物的粗蛋白含量，从而使底物的可饲性大大提高，可最大限度上替代鱼粉等其他动物源蛋白质饲料。本研究中单一饲料原料的成分及含量均有所不同，可能是造成不同酵母增殖效果差异的重要因素。

植酸在植物种子的胚芽和谷物的麸皮中含量较高，尤其是在豆科植物的种子中含量最高。植酸可与常见的矿物元素产生不溶性化合物，大大降低其有效性，因而成为重要的抗营养因子之一。本试验测定结果显示，大豆和豌豆中植酸含量较高，但豆粕中植酸含量甚至低于玉米和小麦。这可能与大豆在压榨获得油脂过程中经历高温高压等物理因素有关。研究报道，酵母菌能够有效降解植物籽实中的植酸，因而有利于单胃动物对饲料中营养物质的吸收和利用，这可能与酵母菌能够产植酸酶有直接关系。本试验中马克思克鲁维酵母在发酵４８ｈ后各原料的植酸含量下降均较为明显，显示出较好的去除效果，因而在实际生产上具有一定的借鉴意义。

抗性淀粉是一种细胞壁成分，部分与水相溶形成粘性物质，阻碍了动物对营养物质的吸收。本试验中酵母菌对玉米、小麦和豌豆等抗性淀粉含量较高的原料降解效果较好，而对大豆和豆粕的抗性淀粉降解效果较差。目前利用微生物发酵法降解植物籽实中的抗性淀粉尚未见报道。笔者认为不同原料中抗性淀粉的类型存在差异，酵母菌在不同底物上的发酵效果也有所不同，分解抗性淀粉可能主要靠分泌的纤维素酶或淀粉酶发挥作用，但由于酵母菌对复杂多糖的利用效果有限，因此仅依靠酵母菌发酵难以达到有效降解饲料中抗性淀粉的目的。

综上所述，不同种类酵母菌对能量型和蛋白型饲料原料的发酵效果存在差异。总体上，经过３种酵母菌发酵后的能量型饲料（小麦和玉米）酸度显著增加，而蛋白型饲料（豌豆、大豆和豆粕）经酿酒酵母和热带假丝酵母发酵后期ｐＨ值升高。通过控制菌种和时间可在发酵早期增加原料中还原糖和粗蛋白的含量，但随着发酵的进行，还原糖逐渐被消耗。此外，３种酵母菌能够有效降解饲料原料中的植酸，但仅对能量型饲料的抗性淀粉有一定的降解效果。

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