乳酸菌（Lactobacillus）是发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，乳酸菌广泛存在于自然界和人畜的消化系统中，几乎所有菌都对人和动物无毒、无害，可以促进人和动物的健康，由于具备多种益生功能，使其在医药、生物技术、食品、饲料等领域得到了广泛的应用。截止2010 年， 我国乳酸菌产业规模已经超过200 亿元，产量突破160万吨。在养殖业，由于抗生素的使用日渐威胁人类的健康和环境安全，世界各国已普遍禁用或限用饲用抗生素，与之相反，微生物饲料添加剂在畜禽养殖业中已经得到广泛的认可和使用，其中最受推崇的就是乳酸菌。乳酸菌在动物体内能发挥许多的生理功能，它们能促进动物生长，调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价； 降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长，提高机体免疫力，防治多种肠道疾病。2008 年12 月我国农业部1126 号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中规定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种，共16 种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）、粪肠球菌（Straptoccus faecium）、屎肠球菌（Enterococcus lactis）、乳酸肠球菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜酸性乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pediococcusacidilacticii）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、产朊假丝酵母（Candida utilis）、酿酒酵母、（Saccharomycescerevisiae）、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus），其中11 种为乳酸菌。

尽管乳酸菌在养殖业中的意义重大，但其生物饲料添加剂的规模还是比较小，目前市场份额大约为10 亿元左右，这主要是因为目前乳酸菌的研究和应用更多地集中在发酵乳制品（益生菌酸奶、益生菌发酵乳饮料、益生菌奶酪）、发酵豆乳制品、功能性食品配料和食品添加剂（如在婴儿配方乳粉、中老年乳粉、果汁等中的添加等）、膳食补充剂（片剂、胶囊等）等方面，研究的方向集中在发酵菌剂的研制和使用等方面，由此，也造成了乳酸菌饲料添加剂研发的滞后。要为消费者提供更多健康的肉类食品，必须加快饲用乳酸菌工业化生产的研究。目前情况下，乳酸菌饲料添加剂的规模化生产需要解决如下三个问题：一是原料廉价易得，最好是废弃的农副产品；二是工艺要低碳环保，尽量减少能源消耗和二次污染；三是操作简便，不需要添加外源物质，就能生产出高密度的乳酸菌。为此，研究者们作出了不懈努力，如刘晓红等以玉米粉、麦麸等为固态基质,对一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）进行了固态混合发酵试验， 培养结束后乳杆菌活菌数可达100.5×108CFU/g（鲜基）；方芳等以玉米粉、豆粕、麦麸为基质对保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌进行固态混合发酵， 在40℃时得出最好发酵结果，各菌活菌数在109CFU/g 以上。许赣荣等则发明了一种利用糖渣培养乳酸菌及生产乳酸活菌饲料的方法，以玉米淀粉制糖工业副产物糖渣为主要原料，添加麸皮、蛋白胨等物质，并采用固态分批、液态分批、或液态补料的方式， 液态培养活菌含量109CFU/mL以上， 固态培养活菌含量109CFU/g 以上的乳酸菌剂。但是，对照规模化生产需要解决的三个问题，上述研究离工业化生产的要求还有一定距离。在我国，每年都有数以万吨计的菠萝渣、罗汉果渣、烧仙草渣、马蹄淀粉废水、马蹄渣等农产品加工废弃物，量大而且相对集中，对其进行资源化利用，意义十分重大。本文研究了植物乳杆菌对上述农副产品废弃物的利用情况，同时发现了一种利用马蹄淀粉废水、马蹄渣生产乳酸菌饲料添加剂的方法。

1.1 材料

1.1.1 菌种

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），本实验室分离保存，标记为LP199。菌剂为干粉，活菌含量400B/g。

1.1.2 各种农副产品废弃物

菠萝渣：菠萝经压榨机压榨取汁后的果渣，取自合浦果园香公司；

罗汉果渣：鲜罗汉果经浸提压榨后的果渣，主要为罗汉果核，取自桂林某公司；

烧仙草渣：烧仙草干草经浸提后的草渣，取自广西宇峰公司；

马蹄淀粉废水：马蹄经匀浆、去渣和流槽沉淀后的废水，取自广西某公司；

马蹄渣：马蹄匀浆经浆渣分离再作压滤后之渣，取自广西某公司。

1.2 方法

1.2.1 可资利用农副产品废弃物的快速筛选

取植物乳杆菌菌剂0.4g， 加入1000mL 灭菌生理盐水中，混匀，制得1×108CFU/mL 的菌种液。将菌种液按1∶10 的比例分别接种到下列试验编号的样品中：

1#：450g 菠萝渣，加450mL 蒸馏水，置1000mL广口瓶中；

2#：450g 罗汉果渣，加450mL 蒸馏水，均质，置1000mL 广口瓶中；

3#：450g 烧仙草渣，加450mL 蒸馏水，均质，置1000mL 广口瓶中；

4#：900mL 马蹄淀粉废水，置1000mL 广口瓶中；

5#：450g 马蹄渣，加450mL 蒸馏水，置1000mL广口瓶中。

接种后，密封置30℃发酵，24h 后，做感官、菌相镜检及pH 值测定，其中pH 用检定合格的pH 计测定。上述样品同时另备一份，相应编号为A、B、C、D、E，做发酵前的感官、菌相镜检及pH 值测定。选取发酵后色泽、气味较好，革兰氏阳性短杆菌较多且纯，pH 值较低的样品作为植物乳杆菌可资源化利用的基质。

1.2.2 LP199 对选用基质营养成分的利用实验

对筛选出的基质，重复上述试验，同时检测其发酵前后的总糖、蛋白质、总酸（以乳酸计）、乳酸、脂肪、淀粉、粗纤维、膳食纤维等营养成分，分析其前后之变化。各成分的检测分别按GB/T 5009.8-2008、GB 5009.5-2010、GB/T 12456-2008、SN/T 2007-2007、GB/T 5009.6-2003、GB/T 5009.9-2008、GB/T 5009.10-2003、GB/T 5009.88-2008 等方法进行。

对固体废渣再做氨基酸检测， 分析其发酵前后之变化。氨基酸的检测按GB/T 5009.124-2003方法进行。

1.2.3 利用选择基质生产乳酸菌剂的试验

试验前，先在现场取样，测可溶性固形物，测pH值，镜检，检测菌落总数。可溶性固形物用手持式折光仪直接读数，菌落总数按GB 4789.2-2010 检测。试验时，先将植物乳杆菌菌种液按1∶10 的比例直接接入基质中过夜进行一级放大， 然后再按同样的比例接种进行培养，发酵24h 后，镜检，感官检查，测pH 值，测乳杆菌数，同时作对照试验。

2.1 可资利用农副产品废弃物的快速筛选结果

用植物乳杆菌LP199 对菠萝渣、罗汉果渣、烧仙草渣、马蹄淀粉废水、马蹄渣等进行了发酵试验，结果如表1 所示。

本试验所用的菌种LP199，为一种植物乳杆菌，系革兰氏阳性杆菌， 分散排列， 菌体大小为0.8-1.0μm×1.0-2.0μm。从表1 中可以看出，植物乳杆菌在菠萝渣中未能占据主导地位， 大量生长的是一种革兰氏阳性链杆菌；罗汉果渣发酵后总体菌量较少，并且酵液发臭； 烧仙草接种培养后呈现混合菌相，pH 值未能显著下降，并且出现产气和腐烂味；因此上述三种废渣均不适合作为生产乳酸菌剂的基质。而马蹄淀粉废水和马蹄渣发酵后，pH 值迅速下降，具有特殊发酵的酸香味，菌体主要为植物乳杆菌，所以本研究首先选取此两种物质作为培养植物乳杆菌的基质。

2.2 LP199 对马蹄淀粉废水和马蹄渣营养成分的利用结果

将LP199 接种于马蹄淀粉废水和马蹄渣后，检测其发酵前后之总糖、蛋白质、总酸等营养成分，结果如表2 所示。

从表2 中可以看出，发酵后，总糖接近零值，而总酸大大增加。总酸成分主要为乳酸，如马蹄淀粉废水中乳酸/总酸比值为82%， 马蹄渣中乳酸/总酸比值为98%，说明LP199 是行同型乳酸发酵，如此高浓度的乳酸足以将其它细菌抑制或杀灭， 这为其免于对基质的热处理从而实现低碳发酵奠定了基础。发酵前后，蛋白质、脂肪、淀粉的含量没有明显变化，提示LP115 和其它大多数乳酸菌一样，缺乏这些物质的分解酶系， 其生长所需因子主要来源于马蹄淀粉废水和马蹄渣中已有的营养物质， 同时也说明此废水和废渣利用前景广阔。

本实验同时检测的还有马蹄渣发酵前后氨基酸含量，结果如表3 所示。

从表3 中可以看出，经LP199 发酵后，马蹄渣中的氨基酸由4.400g/100g 增加到了5.743g/100g，总量增加了30.5%。个例氨基酸中， 只有胱氨酸减少，其余全部增加，增加50%以上的有谷氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸，其中后5 种氨基酸为畜禽必需氨基酸。氨基酸的变化反映出植物乳杆菌LP199 复杂的生理代谢作用，由于氨基酸本身就是乳酸菌的良好底物， 所以发酵后氨基酸的增加可能来源于菌体的增加， 提示LP199菌体是一种优良的单细胞蛋白。

2.3 马蹄淀粉废水、马蹄渣生产乳酸菌剂的试验结果

将菌种放大一级后再分别接种于马蹄淀粉废水和马蹄渣，自然环境条件下密封放置，试验结果如表4 所示。本试验于2012 年12 月23 日和2013 年2月1 日在生产现场进行了两次， 日平均气温20-15℃，结果为两次试验的平均数。

从表4 中可以看出， 马蹄淀粉废水和马蹄渣基质中，含有一定的杂菌，数量在106CFU/mL（g）以上，主要是一些革兰氏阳性小球菌， 如果不接种LP199，24h后， 该菌就会大量繁殖， 菌体密度达到109CFU/mL（g）以上。而接入10%的LP199 一级放大菌液后，LP199 的生长居于主导地位，培养液中几乎全为植物乳杆菌，由于没有其它外源菌，表中乳杆菌的量就是LP199 的量，它在马蹄淀粉废水中的纯度是91.7%，在马蹄渣中的纯度则几乎是100%，而且密度较高，活菌数在109CFU/mL（g）以上。

由于目前我国还没有乳酸菌菌剂的国家或行业标准，如果以农业部光合细菌菌剂的标准作为生物菌剂的判定依据， 则可发现本试验得到的乳酸菌菌剂数量的杂菌率均满足其要求， 是一种优良的生物饲料添加剂， 特别是马蹄渣中还含有大量的膳食纤维（见表2），更显其作为饲料添加剂的优越性。

本文研究发现了一种利用马蹄淀粉废水、马蹄渣生产植物乳杆菌饲料添加剂的新方法， 该方法具有原料廉价易得、工艺低碳环保、操作简便可行的特点，由此生产的生物饲料添加剂可广泛应用于畜禽、水产养殖。

植物乳杆菌属于乳杆菌属（Lactobacillus），其营养要求比较复杂，需要氨基酸、核酸衍生物、维生素和可发酵的糖等，因此，并不是所有的农副产品废弃物都可被其利用，如菠萝渣、罗汉果渣、烧仙草渣就不适用，实际上，还曾做过废弃柑橘和废弃柿子的研究，二者更难被利用；研究发现，马蹄淀粉加工的废弃物是培养植物乳杆菌LP199 的优良基质。马蹄淀粉加工过程中产生的废水、废渣， 可溶性固形物达1.5-2.0%，实际上可看作是马蹄匀浆的上清液（因废渣含水量也达到79.6%），其中蕴含着丰富的营养物质，非常适合植物乳杆菌的生长，植物乳杆菌接种到马蹄淀粉的废水废渣后，能迅速增殖，产生大量的乳酸，使pH 值降低到4.0 以下，抑制和杀灭其它微生物，使杂菌率控制在10%以内，这一培养特性正可以用于生物饲料添加剂的工业化生产， 因其不需要添加任何外源物质，不需要任何热处理措施，甚至可以做到零排放。

马蹄渣更有利于植物乳杆菌LP199 的增殖，与马蹄淀粉废水相比，不仅活菌含量更高，而且菌物更纯，纯度几乎是100%。有趣的是，马蹄渣接种植物乳杆菌LP199 培养后，其氨基酸含量增加了30.5%，这可能归结于菌体蛋白的增加， 提示菌体本身可作为高质量的单细胞蛋白，不过，由于氨基酸的总含量不高， 所以其意义更多地在于植物乳杆菌的大量增殖可使之足以达到发挥对动物的益生作用， 同时通过改善马蹄渣的营养成分，增加其适口性，从而增加其作为生物饲料添加剂的性价比。

采用一级放大，二级10%的接种量，自然环境条件下直接培养，无需任何特殊的工艺，即可将马蹄淀粉废水和马蹄渣变为活菌含量109CFU/mL（g 鲜重）以上的乳酸菌饲料添加剂。由于乳酸菌对环境敏感，不易保存，因此，还需对其活性保存条件作进一步研究。

以年产2.0×106kg 马蹄淀粉来计，马蹄淀粉废水、马蹄渣量将分别达到1.2×107kg 和4.5×106kg 左右，其量大，而且相对集中，因此对其进行资源化利用生产乳酸菌饲料添加剂，前景广阔，同时马蹄湿渣中还含有13.5g/100g 的膳食纤维， 折合干基含量为67.6g/100g，这将大大增加其作为生物饲料添加剂的潜在价值。