一株丁酸梭菌的分离鉴定及其益生特性研究_微生物试验报告与运用_微生物知识

一株丁酸梭菌的分离鉴定及其益生特性研究

2020-10-29 15:08:54 点击：

摘要：本研究探索了丁酸梭菌分离株的益生特性，旨在为其在仔猪日粮中的应用提供理论依据。利用常规方法分离丁酸梭菌并进行纯培养，经生化检测和１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因测序，对分离菌株进行鉴定；采用活菌计数法和牛津杯法研究分离株培养上清对３种致病菌的抑制作用、分离株黏附猪小肠上皮细胞（ＩＰＥＣ－Ｊ２）的特性及其对致病菌黏附细胞的抑制作用；采用细胞计数法研究分离株对ＩＰＥＣ－Ｊ２生长的影响；采用ＥＬＩＳＡ检测分离株处理细胞后培养上清液中细胞因子水平。结果表明，本研究成功分离到一株丁酸梭菌。与对照组相比，丁酸梭菌培养上清对３种致病菌生长抑制效果均显著（Ｐ＜０.０５）；丁酸梭菌可黏附于ＩＰＥＣ－Ｊ２，并且黏附效果最佳的感染复数（ＭＯＩ）为５０，最适处理时长为３ｈ；丁酸梭菌对３种致病菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２均具有显著抑制作用（Ｐ＜０.０５）；丁酸梭菌ＭＯＩ为１、１０和５０时细胞生长正常、形态完好，ＭＯＩ为１００时ＩＰＥＣ－Ｊ２生长受到显著抑制，同时出现部分细胞死亡；ＭＯＩ为１时细胞因子水平无差异，ＭＯＩ为１０、５０和１００时细胞因子水平均显著增高（Ｐ＜０.０５）。综上所述，本研究分离的一株丁酸梭菌具有较好的益生特性，为其在生产中的应用提供了理论依据。

仔猪出生后通过母乳获得免疫保护，而断奶后常表现出抵抗力下降，易发生腹泻，死亡率增加。致病性细菌是引起仔猪肠道疾病的一类病原，例如常见的产肠毒素大肠杆菌（ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ　ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，ＥＴＥＣ）和沙门氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ），引起仔猪腹泻，给猪生产带来了一定的经济损失。为了提高养猪效益，通常在饲料中添加抗生素来防治疾病。虽然抗生素在预防动物疾病、促进畜禽生长、提高饲料转化率和畜产品品质等方面起到了重要作用，但随着抗生素的大量使用，出现了耐药菌株和抗生素残留等问题，严重威胁到畜牧业自身效益和人类健康。

近年来，人们开始研究利用益生菌调节仔猪肠道菌群平衡和免疫发育，以减少或替代抗生素的使用，提高仔猪抗病力。丁酸梭菌是人和动物肠道内的正常菌群，具有调整肠道微生态平衡、产生益生产物和增强机体免疫等作用。２００３年欧盟批准丁酸梭菌作为饲料添加剂用于断奶仔猪和肉鸡。２００９年７月，原农业部批准丁酸梭菌可作为饲料添加剂用于生产，并于２０１３年将其纳入《中国饲料添加剂品种目录（２０１３）》的《附录二》中。目前，丁酸梭菌在提高畜禽生产性能、防治动物细菌性疾病和提高动物性食品安全等方面已经表现出积极的作用。

本研究从健康仔猪粪便中分离鉴定出一株丁酸梭菌，探索该分离株培养上清液对致病性大肠杆菌和沙门氏菌的生长抑制作用，对两类致病菌黏附猪小肠上皮细胞（ＩＰＥＣ－Ｊ２）的抑制作用以及对ＩＰＥＣ－Ｊ２生长和免疫反应的影响，以期为丁酸梭菌在仔猪日粮中的广泛应用提供科学依据。

１　材料与方法

１.１　细胞和菌株

ＩＰＥＣ－Ｊ２、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌Ｋ８８均为天津师范大学生命科学院动物营养与饲料实验室保存。

１.２　主要试剂

ＲＰＭＩ　Ｍｅｄｉｕｍ　１６４０　ｂａｓｉｃ培养基、胰蛋白酶ＥＤＴＡ消化液和胎牛血清均购自Ｇｉｂｃｏ公司；青链霉素、硫酸庆大霉素和ＴｒｉｔｏｎＸ－１００均购自北京索莱宝生物公司；ＴＲＩｚｏｌ试剂盒、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰｓ均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；猪白细胞介素－１β（ＩＬ－１β）、猪白细胞介素－８（ＩＬ－８）、猪肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）检测试剂盒均购自ＢＤ公司。

１.３　主要培养基

梭菌选择培养基（ＴＳＮ培养基），用于丁酸梭菌的分离培养，其配方为：胰蛋白胨１７ｇ／Ｌ、大豆蛋白胨３ｇ／Ｌ、氯化钠５ｇ／Ｌ、磷酸二氢钾２.５ｇ／Ｌ和葡萄糖２.５ｇ／Ｌ；梭菌增殖培养基（ＲＣＭ培养基），用于丁酸梭菌的纯培养，其配方为：酵母浸粉３ｇ／Ｌ、牛肉膏１０ｇ／Ｌ、蛋白胨１０ｇ／Ｌ、可溶性淀粉１ｇ／Ｌ、葡萄糖５ｇ／Ｌ、半胱氨酸盐酸盐０.５ｇ／Ｌ、氯化钠３ｇ／Ｌ和乙酸钠３ｇ／Ｌ；ＬＢ培养基由胰蛋白胨１０ｇ／Ｌ、酵母浸粉５ｇ／Ｌ和氯化钠１０ｇ／Ｌ组成；普通肉汤培养基由蛋白胨１０ｇ／Ｌ、牛肉膏５ｇ／Ｌ和氯化钠５ｇ／Ｌ组成。上述各培养基分别加入２％琼脂即可配成固体培养基。培养基所用的各种化学试剂均为化学纯。

１.４　丁酸梭菌的分离

无菌称取健康断奶仔猪的新鲜粪便５ｇ，用无菌生理盐水稀释至１０－５、１０－６、１０－７３个梯度，分别取２００μＬ粪便稀释液接种于ＴＳＮ培养基中，置于３７℃恒温培养箱中静置厌氧培养４８ｈ，观察菌落形态特征。对可疑菌落进行革兰氏染色，用显微镜油镜观察不同菌落的菌体特征和染色特性，选取符合丁酸梭菌形态特征的菌落划线接种ＲＣＭ培养基继续培养，直到得到可疑菌落的纯培养物。

１.５　丁酸梭菌生理生化及１６Ｓ　ｒＤＮＡ鉴定

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对可疑菌落的纯培养物进行生理生化鉴定。鉴定项目包括硝酸盐还原、明胶液化、吲哚、硫化氢产生以及蜜二糖、松三糖和淀粉的发酵。

将细菌通用引物（２７Ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ－ＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′；１４９２Ｒ：５′－ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴ－ＴＡＣ　ＧＡＣＴＴ－３′）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。离心收集培养至对数生长期的分离株纯培养物，采用ｔａｃｏ试剂盒提取基因组ＤＮＡ，以其为模板，对细菌１６ＳｒＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应参考梁东梅等报道，ＰＣＲ体系５０μＬ：ＤＮＡ模板２μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）１μＬ，ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，上、下游引物各１μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　３９μＬ。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性２５ｓ，６２℃退火２５ｓ，７２℃延伸９０ｓ，４０个循环；７２℃终延伸３ｍｉｎ；１６℃２ｍｉｎ。利用１.０％琼脂糖凝胶对ＰＣＲ扩增产物进行电泳检测，将扩增片段大小为１　５００ｂｐ左右的阳性产物进行纯化，纯化产物送金唯智生物公司进行核苷酸序列测定。利用ＮＣＢＩ数据库中的ＢＬＡＳＴ工具将测序结果进行同源性分析，确定分离株的属种。

１.６　丁酸梭菌抑制致病菌能力的测定

将丁酸梭菌接种于ＲＣＭ培养基，３７℃静置过夜培养４８ｈ，离心，收集培养上清液，置４℃保存，用于分析其培养液抑菌能力。

１.６.１　牛津杯法测量抑菌圈直径　　

试验方法参考梁东梅等报道，将２.０％琼脂水倾注于培养皿中，待凝固后等距离放入４个牛津杯，将含致病菌（浓度为１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）的ＬＢ固体培养基混匀后缓注入平板中，待培养基凝固后，用镊子拔出牛津杯。取１５０μＬ丁酸梭菌培养液加入牛津杯中，同时用ＲＣＭ培养液作为空白对照，试验组和对照组各做３个重复孔。将培养皿在４℃放置２ｈ，待孔内液体完全扩散后转至３７℃倒置培养２４ｈ，测量各孔抑菌圈直径。

１.６.２　活菌计数法进行菌落计数　　

试验方法参考梁东梅等报道，将丁酸梭菌培养液分别与大肠杆菌（浓度为１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）和沙门氏菌（浓度为１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）混合作用，每种致病菌分别做３个重复，作用时长均为０、５、１５、３０和６０ｍｉｎ，然后将致病菌倍比稀释，大肠杆菌稀释液涂布ＬＢ琼脂板，沙门氏菌稀释液涂布普通肉汤琼脂板，３７℃培养２４ｈ，进行菌落计数。每个作用时间点分别做３次菌落计数。

１.７　丁酸梭菌对ＩＰＥＣ－Ｊ２生长的影响

用含１０％胎牛血清、１％青链霉素的ＤＭＥＭ－１６４０培养基培养ＩＰＥＣ－Ｊ２，培养条件是３７℃、５％ＣＯ２。将生长至对数期的细胞接种至１２孔细胞培养板，待细胞生长密度至８０％（细胞浓度为５×１０5地5个／孔），再分别加入ＭＯＩ（ＭＯＩ＝细菌数量／细胞数量）为１、１０、５０和１００的丁酸梭菌，同时设ＤＭＥＭ培养液作为空白对照组，每个处理组做３个重复孔。待丁酸梭菌处理细胞３ｈ后，弃掉培养液，用ＤＭＥＭ清洗３次细胞以去除未黏附的细菌，显微镜下观察细胞生长状态及死亡情况。观察结束后，将每孔细胞消化并收集于离心管中，１　０００ｒ／ｍｉｎ离心４ｍｉｎ，弃上清，加入不含血清的培养液将细胞吹打均匀，经台盼蓝染色后，在显微镜下进行细胞计数。

１.８　丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的测定

１.８.１　丁酸梭菌黏附细胞的时间依赖性　　

将ＩＰＥＣ－Ｊ２接种至２４孔细胞培养板，待细胞生长密度至８０％，分别加入ＭＯＩ为５０的丁酸梭菌，３７℃分别孵育３、６、１２和２４ｈ，每个处理组做３个重复孔。孵育结束后，弃去培养液，用ＤＭＥＭ清洗３次以去除未黏附的丁酸梭菌，然后每孔加入１００μＬ　０.５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，孵育８ｍｉｎ以裂解细胞，然后加９００μＬＰＢＳ终止裂解，吹打混匀后吸出样品，最后将样品进行梯度稀释后涂板计数，即丁酸梭菌黏附数。

１.８.２　丁酸梭菌黏附细胞的剂量依赖性　　

细胞培养至２４孔板的方法同１.８.１，分别加入ＭＯＩ为１、１０、５０和１００的丁酸梭菌，３７℃孵育细胞３ｈ，每个浓度处理组做３个重复孔，用于丁酸梭菌黏附细胞数的测定。细胞裂解和细菌计数方法同１.８.１。

１.９　丁酸梭菌抑制致病菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的测定

将ＩＰＥＣ－Ｊ２接种至２４孔板，待细胞生长密度至８０％，用ＭＯＩ为５０的丁酸梭菌处理３ｈ，然后清洗细胞３次，以去除未黏附细胞的丁酸梭菌，再用大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌分别感染细胞０、３、６、１２和２４ｈ，感染剂量均为１×１０3ＣＦＵ／孔。感染结束后，按照１.８.１方法进行细胞裂解和致病菌计数，每个处理组的每个处理时间均做３个重复孔。

１.１０　丁酸梭菌对ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫应答的影响

将ＩＰＥＣ－Ｊ２接种于２４孔板，待细胞生长密度至８０％，分别使用ＭＯＩ为１、１０、５０和１００的丁酸梭菌作用ＩＰＥＣ－Ｊ２，以不加丁酸梭菌的处理为空白对照组，每个浓度处理做３个重复孔。丁酸梭菌处理细胞３ｈ后，收集培养上清液，按照检测试剂盒说明书测定ＩＬ－１β、ＩＬ－８和ＴＮＦ－α。

１.１１　数据分析

使用Ｅｘｃｅｌ进行数据整理，采用ＳＰＳＳ　２０.０软件ＯｎｅＷａｙＡＮＯＶＡ进行单因素方差分析，并采用ｔ检验进行组间差异性检验，结果以平均值±标准差表示，Ｐ＜０.０５为差异显著。

２　结　果

２.１　分离株的生长性状及显微特征

将分离纯化的菌株划线接种于ＲＣＭ培养基，３７℃厌氧培养２４ｈ，可见菌落直径１～３ｍｍ，呈圆形凸起、边缘整齐、表面湿润光滑有光泽、乳白色或淡奶油色、不透明，且略有酸臭味。将分离菌进行革兰氏染色，油镜下可见菌体为直杆状或稍有弯曲，两端钝圆，革兰氏染色呈阳性（图１）。

２.２　分离株的生化及ＰＣＲ鉴定

对该分离株进行硝酸盐还原、明胶液化、淀粉水解、糖发酵等试验，其鉴定结果如表１。从菌落形态以及生化反应结果来看，该菌株的特征与丁酸梭菌是一致的，初步鉴定该分离株为丁酸梭菌。

提取丁酸梭菌分离株的基因组，以其为模板进行１６ＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后结果见图２，可见一条大小为１　５００ｂｐ左右的特异性条带，与预期条带大小相符。将目的条带进行胶回收纯化和核苷酸测序，并将测序结果在ＮＣ－ＢＩ数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对，结果表明，该菌株的１６ＳｒＤＮＡ基因序列与丁酸梭菌（ＮＣＢＩ登录号：ＫＣ１９６７７７.１）同源性达１００％，因此确定该分离株为梭菌属丁酸梭菌。

２.３　丁酸梭菌抑制致病菌的能力

丁酸梭菌培养上清液抑制致病菌能力的结果见表２和表３。其中表２为牛津杯法测定的试验结果，对照组是ＲＣＭ培养液，其抑菌圈直径为０ｍｍ，对致病菌无抑制作用，而丁酸梭菌培养上清液作用大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌后，抑菌圈直径分别为２５.０、２６.３、２８.４ｍｍ。由此可知，丁酸梭菌培养上清对这３种致病菌均有良好的抑制作用，其中对鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用最强。

活菌计数法试验结果见表３。由表３可知，与丁酸梭菌培养上清液和大肠杆菌作用０ｍｉｎ相比，丁酸梭菌培养上清液作用大肠杆菌５、１５、３０、６０ｍｉｎ后抑菌力分别提高了５３.３３％、５６.６７％、６８.３３％、７８.３３％；与丁酸梭菌培养上清液和猪霍乱沙门氏菌作用０ｍｉｎ相比，丁酸梭菌培养上清液作用猪霍乱沙门氏菌５、１５、３０、６０ｍｉｎ后抑菌力分别提高了５６.６７％、６０.３３％、６９.６７％、７８.６７％；与丁酸梭菌培养上清液和鼠伤寒沙门氏菌作用０ｍｉｎ相比，丁酸梭菌培养上清液作用鼠伤寒沙门氏菌５、１５、３０、６０ｍｉｎ后抑菌力分别提高了５９.６７％、６１.３３％、７０.３３％、８３.３３％，并且随着丁酸梭菌培养上清液作用时间的延长对这３种致病菌的抑制作用均有所增强。由此可见，牛津杯法和活菌计数法测定丁酸梭菌抑菌能力的试验结果是一致的。试验数据表明，丁酸梭菌能够有效抑制３种致病菌的生长，抑制作用由强到弱依次为鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和大肠杆菌。

２.４　丁酸梭菌对ＩＰＥＣ－Ｊ２生长的影响

用不同剂量的丁酸梭菌处理ＩＰＥＣ－Ｊ２细胞３ｈ，显微镜下观察细胞生长状况，当ＭＯＩ为０、１、１０和５０时细胞生长状况均良好，表现为细胞透明度大、折光性强、轮廓不清，当ＭＯＩ为１００时，细胞折光性降低、轮廓增强、细胞之间空隙增大、细胞形态不规则，少量细胞甚至死亡，漂浮在细胞培养液中。由此可见，ＭＯＩ为１、１０和５０时丁酸梭菌对细胞的正常生长无可见影响，当ＭＯＩ为１００时，丁酸梭菌会影响细胞的正常生长，造成细胞损伤甚至死亡。显微镜观察后，将细胞消化收集，并进行台盼蓝染色和细胞计数，结果见图３。由图３可知，与对照组相比，ＭＯＩ为１、１０和５０时试验组细胞数均无显著差异，ＭＯＩ为１００时试验组细胞数显著降低（Ｐ＜０.０５），由此可见，丁酸梭菌处理浓度ＭＯＩ为１００时影响了细胞的正常生长。

２.５　丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２的能力

不同作用时间对丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的影响见表４。由表４可知，与丁酸梭菌作用细胞３ｈ相比，丁酸梭菌作用细胞６、１２ｈ，其黏附指数分别增加４.９％、４.０％，丁酸梭菌作用２４ｈ时，黏附指数降低了１.８％，无显著差异（Ｐ＞０.０５），其中作用时长为６ｈ时丁酸梭菌黏附细胞的数量最多，说明丁酸梭菌对猪肠上皮细胞具有很好的黏附性。不同作用浓度对丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的影响见表５。由表５可知，与ＭＯＩ为１相比，ＭＯＩ为１０、５０、１００时，丁酸核菌的黏附能力均显著增加（Ｐ＜０.０５），且以ＭＯＩ为５０时丁酸梭菌的黏附能力最强。显微观察发现，ＭＯＩ为１００时，较多的细胞形态发生了改变，并伴有部分细胞漂浮于培养液中，因此，丁酸梭菌处理浓度ＭＯＩ为１００时对细胞具有损伤作用。

２.６　丁酸梭菌对致病菌黏附ＩＰＥＧ－Ｊ２的影响

丁酸梭菌对致病菌黏附ＩＰＥＧ－Ｊ２的影响结果见表６。由表６可知，与大肠杆菌刺激细胞０ｈ相比，大肠杆菌刺激细胞３、６、１２和２４ｈ时，其黏附数分别降低了１１％、３６％、４３％和２５％；与猪霍乱沙门氏菌刺激细胞０ｈ相比，猪霍乱沙门氏菌刺激细胞３、６、１２和２４ｈ时，其黏附数分别降低了２５％、４０％、５０％和１７％；与鼠伤寒沙门氏菌刺激细胞０ｈ相比，鼠伤寒沙门氏菌刺激细胞３、６、１２和２４ｈ时，其黏附数分别降低了３５％、４７％、５５％和１６％；并且３种致病菌均以作用细胞１２ｈ时其黏附数降低为最多。试验数据表明，丁酸梭菌能够有效抑制３种致病菌黏附ＩＰＥＧ－Ｊ２，其抑制效果由强到弱依次是鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌。

２.７　丁酸梭菌对ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫应答的影响

丁酸梭菌对ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫应答的影响见图４，与对照组相比，丁酸梭菌处理浓度ＭＯＩ为１时，ＩＬ－１β、ＩＬ－８和ＴＮＦ－α的浓度均没有显著变化（Ｐ＞０.０５）；丁酸梭菌处理浓度ＭＯＩ为１０时，ＩＬ－８和ＴＮＦ－α的浓度均显著增加（Ｐ＜０.０５），而ＩＬ－１β的浓度没有显著变化（Ｐ＞０.０５）；丁酸梭菌处理浓度ＭＯＩ为５０和１００时，ＩＬ－１β、ＩＬ－８和ＴＮＦ－α的浓度均显著增加（Ｐ＜０.０５）。

３　讨　论

３.１　丁酸梭菌抑菌能力

本研究分别采用牛津杯法和活菌计数法分析获得丁酸梭菌分离株抑菌活性，结果表明丁酸梭菌分离株对大肠杆菌和沙门氏菌均具有很强的抑制作用。已有研究表明，丁酸梭菌可能通过丁酸、抗菌肽等物质抑制致病菌的生长。贾丽楠等研究表明，丁酸梭菌发酵液上清对大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌等均具有明显的抑制作用，并且进一步研究发现，起抑菌作用的为有机酸、蛋白或多肽类物质。威胁断奶仔猪肠道健康的致病菌除大肠杆菌和沙门氏菌外，还有其他病原菌如丹毒杆菌和链球菌等，因此，丁酸梭菌对于其他动物肠道病原菌的生长繁殖是否具有抑制作用还有待进一步研究。

３.２　丁酸梭菌黏附及竞争性黏附能力

本研究的３种肠道致病菌均是通过定植于动物肠道产生一些对动物生长有害的产物，从而导致动物发病。大肠杆菌主要通过菌毛及纤毛蛋白结构中的黏附因子定殖于小肠黏膜并与小肠黏膜上皮细胞上的相应受体结合，释放肠毒素引起腹泻。沙门氏菌是引起６个月以下仔猪副伤寒的主要病原菌，菌体表面有菌毛，利于菌体在黏膜及组织细胞上黏附，不利于病原菌的清除。

丁酸梭菌发挥益生作用主要是通过定植在细胞表面后竞争营养物质和黏附部位，从而阻挡病原菌与细胞表面的受体结合，达到抑制致病菌黏附细胞的目的，在一定程度上降低致病菌的增殖。由于在动物体内很难准确的判定细菌对细胞的黏附能力，因此应用体外细胞试验研究细菌的黏附能力是目前最常用的方法。本研究采用ＩＰＥＣ－Ｊ２为试验模型，用丁酸梭菌分离株作用细胞后检测其黏附能力。利用不同浓度的丁酸梭菌黏附细胞，检测黏附数的变化。试验结果表明，丁酸梭菌对肠上皮细胞具有较好的黏附性，结合丁酸梭菌对细胞生长状况的影响及其黏附细胞的结果，最终确定丁酸梭菌的最佳ＭＯＩ为５０。本研究中发现，丁酸梭菌ＭＯＩ为１００时，会引起细胞损伤甚至死亡，并且丁酸梭菌的黏附数会下降，可能是因为丁酸梭菌产生丁酸等代谢产物使细胞培养液的ｐＨ降低，对细胞生长产生了不利影响。用丁酸梭菌的最佳感染浓度处理细胞，随着作用时间的延长，丁酸梭菌黏附细胞的能力增加，但是其黏附数差异并不显著，为缩短试验周期，后续试验选择黏附的最适时长为３ｈ，当作用时间为２４ｈ时，丁酸梭菌黏附能力下降，这可能是由于细胞培养液中的营养物质用尽，也可能是由于细胞表面的黏附受体有限，导致丁酸梭菌黏附数达到饱和导致黏附率下降，关于这一现象出现的原因目前在丁酸梭菌上研究较少，需要进一步研究。

梁东梅等研究发现，植物乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌均在作用细胞２４ｈ时黏附能力开始下降，与本试验结果一致。刘海鸿等研究发现，乳酸杆菌在作用２和４ｈ时黏附能力开始下降，本试验结果与此不同。这种黏附效果和细胞生长状况的差异可能是由于试验菌株类型、使用菌株浓度及其代谢产物、使用细胞类型等不同造成的。丁酸梭菌抑制致病菌黏附结果表明，丁酸梭菌能够显著抑制致病菌黏附，这主要可能是由于丁酸梭菌竞争性黏附细胞以后占据了黏附位点，抑制致病菌与肠上皮细胞表面的受体结合。但是当致病菌作用时间达到２４ｈ时，丁酸梭菌的抑制能力降低，这可能是由于致病菌释放的内毒素等有害物质对细胞产生了毒性作用，影响了细胞及益生菌的正常生理功能。

３.３　丁酸梭菌对ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫应答的影响

丁酸梭菌作为饲料添加剂，可以通过激活机体的免疫应答，增加免疫球蛋白ＩｇＡ和ＩｇＭ的含量，激活自然杀伤细胞和巨噬细胞，从而提高机体的免疫能力。炎症细胞因子是一类可以调节机体炎症反应的多肽类物质总称。ＩＬ－８主要由单核－巨噬细胞产生，定向游走到反应部位并释放一系列活性产物，这些活性物质导致机体局部的炎症反应，达到杀菌目的，但是释放较多会引起细胞损伤。ＩＬ－１β促进Ｂ细胞增殖和分泌抗体，调节免疫应答，参与组织修复等。ＴＮＦ－α是机体重要的炎性因子，它的主要作用是调节免疫细胞的功能，杀伤肿瘤细胞，引起细胞凋亡和炎症反应，参与组织损伤修复等。本试验结果表明，丁酸梭菌可以上调炎症因子ＩＬ－８、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α基因的表达。杨静试验结果表明，随着丁酸梭菌及磷壁酸处理浓度的增加，促炎因子ＩＬ－８的ｍＲＮＡ表达量增加，与本试验结果相符。张传健研究发现，与对照组相比，丁酸梭菌组和抗生素组均能提高ＴＮＦ－α的含量，与本试验结果一致。由此可见，丁酸梭菌对动物肠道免疫起到一定的刺激作用，这种微弱的刺激可引起适量炎症细胞因子的产生，不会损伤肠上皮细胞的完整性，有利于增强肠道黏膜免疫防御功能，对动物肠道健康有一定的积极作用。

综上所述，分离得到的丁酸梭菌培养上清能够抑制产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的生长，且丁酸梭菌对猪肠上皮细胞具有良好的黏附能力，能够有效抑制产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的黏附，为丁酸梭菌在仔猪日粮中的应用提供科学依据，并且探索出了丁酸梭菌作用细胞的合适浓度和时长，为深入研究丁酸梭菌调节仔猪肠道健康机理奠定了基础。

４　结　论

本研究从健康断奶仔猪粪便中成功分离到一株丁酸梭菌，该分离株能够显著抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌的生长，能够黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２且能抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌的黏附，上调炎症因子的表达，激活ＩＰＥＣ－Ｊ２的免疫反应，对动物肠道健康有一定的积极作用。

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一株丁酸梭菌的分离鉴定及其益生特性研究

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