菌酶协同发酵饲粮对仔猪生长性能、养分消化率、血清生化指标和肠道屏障功能的影响

2020-12-30 09:01:53 点击：

摘要：本试验旨在探究菌酶协同发酵饲粮对仔猪生长性能、养分消化率、血清生化指标和肠道屏障功能的影响。试验选取96头42日龄(8.99±0.75)kg“杜×长×大”杂交仔猪,按体重一致原则随机分为对照组(CON组,基础饲粮)抗生素组(AB组,基础饲粮＋75mg/kg金霉素)、12h发酵组(12h FER组,12h发酵饲粮)和24h发酵组(24h FER组,24h发酵饲粮),每个组8个重复,每个重复3头猪,试验期21d。结果表明与CON组相比,12h FER组和24h FER组仔猪平均日增重(ADG)均显著提高(P<0.05),料重比(F/G)和腹泻率显著降低(P<0.05);与AB组相比,24h FER组仔猪ADG显著提高(P

仔猪断奶后，生长缓慢、腹泻率高、肠道屏障功能减弱等问题严重制约猪养殖行业的发展。因此，提高仔猪断奶期的生长性能和改善其肠道健康是养猪行业发展的重中之重。发酵饲料因具有绿色、安全、廉价易得等优点，同时可促进仔猪生长、缓解腹泻，引发人们广泛关注。研究表明，饲喂发酵豆粕可提高仔猪平均日增重（average dailygain，ADG），显著降低料重比（feed/gain，F/G）。饲喂发酵大豆蛋白可提高仔猪ADG和降低F/G，且ADG与发酵大豆蛋白的添加量呈线性正相关。Kiers等研究也发现，饲粮中添加20%由根霉和枯草芽孢杆菌联合发酵的大豆可促进仔猪生长，显著降低仔猪腹泻率。此外，越来越多的研究表明，添加酶制剂可提高微生物发酵的效率。在发酵过程中，菌和酶能起到很好的协同作用，酶制剂的使用可提高发酵效率、缩短发酵时间，菌酶协同使用的效果要优于菌和酶单独使用时的效果。研究表明，菌酶协同处理的豆粕粗蛋白质（CP）含量由47.62%提高到56.72%，特定的菌酶协同发酵可以提高饲粮中乳酸含量，降低饲料pH，但有关菌酶协同发酵饲粮在仔猪上的应用及其对仔猪肠道健康的影响的研究还较少。因此，本研究旨在探究菌酶协同发酵饲粮对仔猪生长性能、养分消化率、血清生化指标和肠道屏障功能的影响，为菌酶协同发酵饲粮在仔猪上的应用提供理论支撑，为减少抗生素的使用和仔猪健康养殖提供科学资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种购自中国普通微生物保藏中心，且符合《饲料添加剂品种目录（2013）》规定。复合酶制剂来自于北京昕大洋怀安科技发展有限公司。MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、马铃薯葡萄糖（PDA）琼脂培养基、乳杆菌选择性（LBS）琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。发酵桶购自广州博善生物科技股份有限公司。

1.2 试验设计

试验选择96头42日龄健康的“杜×长×大”杂交猪，按体重［（8.99±0.75）kg］相近原则随机分为4组：对照组（CON组，基础饲粮）、抗生素组（AB组，基础饲粮＋75mg/kg金霉素）、12h发酵组（12h FER组，12h发酵饲粮）和24h发酵组（24hFER组，24h发酵饲粮），每组8个重复，每个重复3头猪，试验期21d。

1.3 试验饲粮

参照NRC（2012）仔猪营养需要配制玉米-豆粕型基础饲粮（粉状），基础饲粮组成及营养水平见表1。发酵饲粮各原料组成比例与基础饲粮一致，发酵工艺参照专利（专利号：201910736307.0）。在底物中加入水、酶制剂并接种微生物于发酵桶中搅拌均匀后在26～30℃条件下分别密封发酵12和24h。发酵完成后，按饲粮配方加入除底物以外的其他原料，混合均匀后用以饲喂。

1.4 饲养管理

试验在四川农业大学科研基地进行。试验前冲洗试验场地，并全面消毒、密闭熏蒸（甲醛：高锰酸钾=2：1）。仔猪自由采食和饮水，其他管理按照试验基地规定进行。每天记录猪的精神状态、腹泻状况和采食量。

1.5 指标测定

1.5.1 生长性能

于试验第1天和第22天早上对经空腹处理的试验仔猪称重，计算ADG；每日记录采食量，用以计算平均日采食量（ADFI），并根据采食量和增重计算F/G。腹泻率：每天早晚喂料期间仔细观察粪便情况，并对每个重复的腹泻头次和评分进行详细的记录。当腹泻评分大于或等于2时，判定该仔猪发生腹泻，评分标准见表2。腹泻率计算参照廖波等。计算公式如下：

腹泻率=［腹泻仔猪头数/（仔猪头数×试验天数）］×100。

1.5.2 养分消化率

饲粮样品采用四分法收集，每个组取500g左右，发酵饲粮每日取约100g装入样品袋并记号，-20℃保存。试验结束后，将每日的发酵饲粮混合均匀，用于测定总能（GE）以及干物质（DM）、粗灰分、CP、粗脂肪（EE）和总磷（TP）的含量。粪便采用全收粪法，以重复为单位，收集每个重复试验第18～21天排出的全部粪便，每次收集的粪便称重后，按每100g加10%硫酸（H2SO4）10mL进行固氮处理滴加数滴甲苯防腐，混匀粪样，-20℃保存。试验结束后，将每个重复的所有粪样搅拌混合均匀后，置于65℃烘箱干燥，粉碎，待测。饲粮和粪便中养分含量测定参照张丽英的方法。养分消化率以盐酸不溶灰分为指示剂（测定方法参照GB/T 23742-2009）进行计算，计算公式如下：

某养分消化率（%）=（1-（A1×F2）/（A2×F1））×100。

式中：F1和F2分别代表饲粮和粪便中该养分含量（%）；A1和A2分别代表饲粮和粪便中盐酸不溶灰分含量（%）。

1.5.3 血清生化指标

试验第22天，仔猪空腹称重后，用真空采血管于前腔静脉采血，室温下静止放置30min，然后3500r/min离心10min分离血清，-20℃保存，待测血清指标。血清中总蛋白（TPROT）、尿素氮（UREA）、白蛋白（ALB）、葡萄糖（GLU）含量和碱性磷酸酶（ALP）活性均采用试剂盒（瑞士罗氏公司）由全自动血清生化仪（HITACHI，日本）测定。血清二胺氧化酶（DAO）活性采用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（北京诚林生物科技有限公司），按照说明书进行测定。

1.5.4 空肠黏膜消化酶活性

测定之前肠道黏膜样品进行匀浆，称取一定量（0.3～0.5g）的黏膜样品，按质量体积比1：9（g/mL）加入生理盐水，进行超声粉碎匀浆，3500r/min离心10min，取上清液，制成10%匀浆液，-20℃保存待测。空肠黏膜蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶和淀粉酶活性采用试剂盒（南京建成生物工程研究所），按照说明书进行测定。

1.5.5 小肠形态和杯状细胞

用4%多聚甲醛将肠道组织固定，然后经脱水、包埋、切片和染色等标准操作程序处理后，用光学显微镜镜检并拍照，每个样品选取10个走向平直且形态完整的绒毛和隐窝进行测定，并取相应绒毛上的杯状细胞计数。测定参照廖波等的方法。

1.5.6 肠道屏障相关基因mRNA的相对表达量

采用实时荧光定量PCR测定空肠和回肠闭合小环蛋白-1（ZO-1）、闭合小环蛋白-2（ZO-2）、黏蛋白2（MUC2）、密闭蛋白（OCLN）和封闭蛋白-1（CLDN-1）mRNA相对表达量。总RNA的提取按照试剂盒（TrizolReagent，TaKaRa，日本）操作说明进行，RNA质量检测使用核酸蛋白检测仪（BeckmanDU-800，CA，美国）于260nm检测，A260/A280表示RNA的纯度，该比值在1.8～ 2.0说明RNA纯度较好。cDNA的合成按照逆转录试剂盒（PrimeScriptTM Regent Kit，TaKaRa，日本），反应结束后-20℃保存待用。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）搜索基因序列，运用Primer 5进行引物设计，由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表3。用实时荧光定量PCR仪（ABI 7900HT real-time PCR System，ABI，美国）进行测定，反应荧光染料为SYBR Green I（TaKaRa，日本）。反应体系为10.0μL：5.0μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、0.5μL 上游引物、0.5μL下游引物、3.0μL双蒸水和1.0μL cDNA模板。选择β-肌动蛋白作为空肠和回肠黏膜的内参基因，使用2-ΔΔCt方法计算目的基因相对表达量。

1.6 数据统计分析

试验数据用Excel 2010进行初步整理与计算，然后用SPSS 20.0进行单因素方差分析，并结合Duncan氏法进行多重比较，以P<0.05为差异显著判断标准，结果以平均值和集合标准误表示。

2 结果与分析

2.1 发酵饲粮对仔猪生长性能的影响

如表4所示，与CON组相比，12hFER组和24hFER组组仔猪ADG均显著提高（P<0.05），腹泻率和F/G显著降低（P

2.2 发酵饲粮对仔猪养分消化率的影响

如图1所示，与CON组和AB组相比，12h FER组和24hFER组DM、CP、EE、Ash、GE和TP的消化率均显著提高（P

2.3 发酵饲粮对仔猪血清生化指标的影响

如表5所示，与CON组相比，24hFER组仔猪血清中DAO活性显著降低（P

2.4 发酵饲粮对仔猪空肠黏膜消化酶活性的影响

如表6所示，与CON组相比，AB组和24h FER组仔猪空肠蔗糖酶活性均显著提高（P<0.05）；与12h FER组相比，24hFER组仔猪空肠蔗糖酶活性显著提高（P

2.5 发酵饲粮对仔猪小肠形态和杯状细胞数量的影响

如表7所示，在十二指肠中，与CON组相比，12hFER组和24h FER组仔猪绒毛高度/隐窝深度（绒隐比）显著提高（P<0.05），12hFER组仔猪隐窝深度显著降低（P<0.05）；与AB组相比，12hFER组仔猪绒隐比显著提高（P<0.05），隐窝深度显著降低（P<0.05）。在空肠中，与CON组相比，24hFER组仔猪隐窝深度显著降低（P<0.05），12h FER组仔猪空肠杯状细胞数量显著升高（P<0.05）；与AB组相比，12hFER 组仔猪空肠杯状细胞数量显著升高（P<0.05）。在回肠中，与CON组和AB组相比，12h FER 组和24h FER组仔猪空肠绒毛高度显著提高（P

2.6 发酵饲粮对仔猪空肠和回肠紧密连接蛋白相关基因表达的影响

如图2所示，在空肠中，24hFER组仔猪空肠CLDN-1和ZO-1基因的mRNA相对表达量显著高于其他3组（P<0.05）。在回肠中，与CON组和AB组相比，12hFER组和24hFER组仔猪OCLN基因的mRNA相对表达量显著升高（P<0.05）

3 讨论

研究表明，饲料经发酵或者添加酶制剂均可以缓解仔猪腹泻，提高饲料利用率，改善仔猪生长性能。Chang等研究指出，乳酸菌发酵饲粮能显著提高仔猪ADG和养分消化率。Wang等在饲粮中添加24%发酵豆粕，结果显示，发酵豆粕显著提高了仔猪ADG，同时降低了F/G。本试验研究发现，2组菌酶协同发酵饲粮均能显著提高仔猪ADG，显著降低F/G，并有效缓解仔猪腹泻，其腹泻率分别降至6.55%和8.53%，与上述研究结果相似。这可能是由于菌酶协同发酵饲粮中含有大量有活性的乳酸菌，一方面，乳酸菌的增殖可产生大量的乳酸，降低饲粮pH，从而使易引起仔猪腹泻的大肠杆菌数量大幅减少，仔猪腹泻率降低，从而减少了营养物质的流失；另一方面，研究发现，菌酶协同发酵提高了饲粮的可消化性，菌酶协同发酵兼具发酵和酶解的功能，不仅能缩短发酵周期，提高发酵效率，还能有效提高饲料的酶解程度，经酶解后的饲粮更易于被仔猪的消化和吸收。此外，各试验组仔猪ADFI无显著差异，但2个发酵组ADFI比对照组高50～70g/d。分析其原因，可能有以下2点：1）饲料经乳酸菌发酵后产生的乳酸等有机酸使饲粮具有酸香味，且适口性有所增强，从而促进动物的采食；2）仔猪采食发酵饲粮时，大量益生菌随之进入仔猪肠道内，有益菌群在肠道内定植后利用微生物产生的代谢产物，帮助机体分解食物并促进消化吸收，有利于促进仔猪采食。动物的生长性能与消化性能密切相关，即动物对饲粮中的养分消化率越高，其生长性能越好。本试验中，12h FER组和24h FER组DM、CP、EE、Ash、GE和TP消化率显著提高，这说明12和24h发酵可提高仔猪对营养物质的利用率，进而改善仔猪生长性能。

血清中ALB、TPROT含量能够反映机体的新陈代谢功能，血清中DAO活性是反映肠道功能的重要指标之一。其中ALB合成于肝脏，具有清除自由基、抗凝血等生理功能。本研究的结果显示，24hFER组仔猪血清DAO活性显著低于其他组，2个发酵组血清ALB含量与CON组相比有提高的趋势，表明24hFER组仔猪的肠道功能得以增强，同时，12h FER组和24hFER组仔猪的代谢状况可在一定程度上改善。

空肠内含有大量消化酶，如淀粉酶、蔗糖酶等，是仔猪对营养物质进行消化和吸收的重要场所。消化酶的活性可受多种因素影响，如饲粮的种类、外源性激素、抗营养因子和动物的年龄等。冯尚连等研究表明，乳酸可以提高仔猪空肠二糖酶活性。本试验研究结果表明，24hFER组仔猪空肠蔗糖酶活性显著高于对照组，12h FER组蔗糖酶活性比对照组高39.04%。所以，可能是发酵饲粮中乳酸提高了蔗糖酶的活性。

小肠的绒毛高度和隐窝深度及绒隐比是反映肠道通透性、吸收性和肠道黏膜功能是否完善的重要指标。魏小兵等研究表明，无抗发酵饲粮组仔猪空肠和回肠绒毛高度显著升高，隐窝深度降低，绒隐比显著提高，杯状细胞数量显著增加。张俊等在肉鸡上的研究也得到相似的结果。本试验结果表明，与CON组相比，12h FER组仔猪十二指肠隐窝深度显著降低，十二指肠绒隐比和回肠绒毛高度显著提高，空肠杯状细胞数量显著增加，与前人研究结果基本一致。这表明本试验所采用的菌酶协同发酵饲粮能够促进仔猪小肠的生长发育，改善仔猪肠道组织形态，保障肠道黏膜的完整性，这与生长性能和养分消化率的结果相对应，说明12和24h发酵可能是通过促进肠道组织结构的发育来促进仔猪对营养物质的消化与利用，进而促进仔猪生长。

有研究指出，肠道上皮细胞是肠道机械屏障发挥功能的关键。OCLN、CLDN-1、ZO-1、ZO-2等紧密连接蛋白是连接肠上皮细胞的重要组分。研究发现，OCLN和CLDN-1可以通过影响紧密连接，影响上皮细胞的通透性及肠道屏障功能。Woo等研究了发酵大麦和豆粕混合饲粮对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）致炎的小鼠肠道屏障功能的作用，结果发现发酵大麦和豆粕混合物显著上调了小鼠结肠中OCLN、CLDN-1和ZO-1的基因表达量。张俊等的研究结果表明，益生菌发酵饲粮可以显著提高肉鸡回肠中封闭蛋白-3（CLDN-3）和ZO-1基因的表达量。本试验研究结果表明，24h FER组仔猪空肠黏膜CLDN-1和ZO-1基因的相对表达量显著上调，12hFER组和24h FER组仔猪回肠OCLN基因相对表达量显著上调，与小肠组织形态结果相对应，说明饲喂12和24h发酵饲粮能提高仔猪肠道绒毛高度和绒隐比，上调CLDN-1、ZO-1和CLDN基因的表达，维持小肠组织的完整性和选择通透性，增强肠道的机械屏障功能。肠道黏膜表面覆盖有黏液，黏液层是肠道内共生菌的主要栖息场所，是肠道重要的化学屏障，具有保护肠道，使其免受机械损伤的作用。杯状细胞可分泌黏蛋白，对维持肠道黏膜健康起重要作用。有研究表明，乳酸菌可通过调节杯状细胞影响肠道的屏障功能。本试验结果表明，与对照组相比，12h发酵饲粮可显著提高空肠杯状细胞数量，回肠杯状细胞数量提高46.53%，与前人研究结果一致。所以，可能是发酵饲粮中乳酸菌促进了杯状细胞的增殖。

4 结论

本试验表明，发酵饲粮可改善肠道健康，提高养分消化率，降低腹泻率，从而提高仔猪生长性能，发酵饲量效果相当于或优于金霉素，发酵12与24h饲粮效果相当。

生物发酵饲料的制作方法

生物发酵饲料不是什么高大上的东西，只要有专业的饲料发酵剂+原料就可以自己制作。所需的材料和设备都要求不高，具体做法是：

1.按照配方分别称取原料（参考配方1：玉米50%、豆粕或菜粕50%；参考配方2：60%全价配合饲料、豆粕40%；参考配方3:100%的猪鸡鸭全价饲料。配方中蛋白饲料越多效果越好。

2.选用含复合菌+复合酶制剂组合的酶菌结合饲料发酵剂，特别推荐选用“99多功能饲料发酵剂”这个发酵剂，500克/包，市场售价仅25元，发酵1-2吨饲料，使用量越大效果越好，菌种品种和数量多，且含丰富酶制剂分解饲料中的粗纤维效果好，且发酵完成的饲料香甜味和适口性更好。

3.将菌种溶于温水中半小时以上，加入少量红糖或糖蜜效果更好，然后均匀喷洒在发酵料中，边拌边洒，使发酵料的含水量达到手捏成团、落地即散的程度，一般料含水量55%-60%比较好。

4.将拌好的发酵饲料装于塑料桶或陶瓷缸中或水泥池内，稍将料压实后密封让其自然发酵。一般气温在25℃以下时，发酵时间为7--10天，气温在25℃以上时，则为3--5天。

5.发酵后，pH值达到4--5以下，并有浓郁的酒香味，即为发酵成功。

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