1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

浓酱兼香型酒醅样品：采自湖北白云边酒业股份有限公司酿酒车间（第三轮次、第四轮次、第五轮次和第六轮次），各轮次的入池和出池酒醅样品采集数量均为2份，各酒醅样品pH值在3.2～4.5之间。

1.1.2 化学试剂

溶菌酶（20000U/mg）：盖云天（武汉）生物技术有限公司；Ezup柱式细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提试剂盒、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate，dNTP）、DNA聚合酶（5U/μL）：宝生物工程（大连）有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏（均为生化试剂）：安琪酵母有限公司；葡萄糖、吐温80、磷酸氢二钾、无水乙酸钠、乙酸、柠檬酸氢二铵、七水硫酸镁、一水硫酸锰（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯、正丙醇、叔戊醇（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培养基

MRS液体培养基：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、葡萄糖5g、无水乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-801mL、七水硫酸镁0.2g、一水硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL，pH值调至6.5～6.8，分装灭菌，115℃高压灭菌30min。

MRS固体培养基：在MRS液体培养基中加入琼脂粉20g，115℃高压灭菌30min。

改良MRS固体培养基：在MRS固体培养基中添加1.5%的CaCO3。

酸度耐受性培养基：在MRS液体培养基的基础上，使用乙酸-乳酸（1∶1，V/V）混合酸调整其pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5。

乙醇耐受性培养基：在MRS液体培养基的基础上，按体积分数分别加入2%、4%、6%、8%、10%的无水乙醇。

1.2 仪器与设备

ECLIPSE80i相差显微镜：日本Nikon公司；ZHJH-C1115B超净工作台、ZXDP-A2160全自动新型电热培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；T3000PCR仪：德国Biometra公司；SYDR/1305凝胶成像仪：美国Syngene公司；UV-5900PC紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；YXQ-LS-50Sll立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；7890A气相色谱（gas chromatography，GC）仪、1260c高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 浓酱兼香型酒醅乳酸菌的分离

称取不同轮次酒醅样品10g，加入90mL无菌水中，30℃、170r/min摇床振荡0.5h，经系列稀释后，取适当稀释度的菌液各1mL涂布于MRS固体培养基上，封口，置于30℃恒温培养箱72h静置培养。待乳酸菌长出后，随机挑取形态不同的单菌落，在改良MRS固体培养基上划线分离纯化2～3次，挑取产生透明圈的单菌落于MRS液体培养基中，30℃静置培养48h，进行革兰氏染色和过硫化氢实验，将革兰氏染色呈阳性且过硫化氢实验呈阴性的菌株初步确定为乳酸菌。分离乳酸菌时MRS培养基中均添加100U/mL制霉菌素，以抑制酒醅中酵母菌的生长。

1.3.2 浓酱兼香型酒醅乳酸菌的分子生物学鉴定

挑取纯化后的乳酸菌单菌落接种于MRS液体培养基中，30℃、静置培养48h，用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，完成后置于-20℃冰箱中保存备用。以分离菌株的基因组DNA为模板，采用乳酸菌16SrDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）与1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对其16S rDNA进行PCR扩增。PCR扩增体系：2×Power Taq MaserMix 25μL，DNA模板1μL，引物27F和1492R各1μL，双蒸水（ddH2O）22μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸90s，30个循环；72℃再延伸10min。取5μLPCR扩增产物，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。取1400bp左右的16S rDNA PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。采DNAStar软件对测序结果进行人工校对。校正以后的序列提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中进行BLAST同源序列搜索，比较测试菌株和已知乳酸菌菌株之间的亲缘关系及其系统地位。根据同源序列搜索结果，用DNAMAN6.0校准排齐序列，采用MEGA5.2软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法，1000次Bootstrap检验构建系统发育树。

1.3.3 不同轮次布氏乳杆菌生长特性的测定

耐酸能力的测定：挑取布氏乳杆菌单菌落接种于MRS液体培养基，装液量20mL/25mL，30℃静置培养48h，进行活化。按1%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基，装液量20mL/25mL，30℃静置培养24h，作为种子液。将种子液按1%（V/V）的接种量分别接种到不同pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5）的MRS液体培养基中，装液量20mL/25mL，30℃静置培养48h，将菌液稀释一定倍数，采用紫外分光光度计测菌液的OD600nm值。

耐乙醇能力的测定：将布氏乳杆菌种子液按1%（V/V）的接种量分别接种于含不同乙醇体积分数（0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%）的MRS液体培养基中，装液量20mL/25mL，30℃静置培养48h，将菌液稀释一定倍数，采用紫外分光光度计测菌液的OD600nm值。

耐高温能力的测定：将布氏乳杆菌种子液按1%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基中，装液量20mL/25mL，分别在37℃、41℃、45℃、50℃条件下，静置培养48h，将菌液稀释一定倍数，采用紫外分光光度计测菌液的OD600nm值。

1.3.4 不同布氏乳杆菌株液体发酵实验

将布氏乳杆菌种子液按2%（V/V）的接种量接种于200mL MRS液体培养基，摇匀，用无菌不透气保鲜膜封口，密闭，28℃恒温静置发酵3d。发酵结束后，将发酵液过膜处理，采用高效液相色谱分析发酵产物差异。

1.3.5 发酵产物中有机酸的测定

取布氏乳杆菌发酵液，涡旋振荡混匀，直接用5mL的注射器（不带针头）取不同菌株发酵液5mL，先用0.45μm有机滤膜初步过滤，再用0.22μm有机滤膜注入2mL的液相进样瓶中，每一个处理条件平行三次。采用高效液相色谱法检测有机酸，HPLC条件：Bio-RadAminexHPX-87H色谱柱（300mm×7.8mm×9μm），柱温30℃，检测器二极管阵列紫外-可见光检测器，检测波长210nm，流速0.6mL/min，进样量10μL，流动相为4mmol/L硫酸溶液。

1.3.6 数据处理

通过SPSS22.0软件分析不同样本间是否存在显著性差异，对数据进行单因素方差分析，使用Tukey方法，假设样本间方差相等，若Tukey HSD检验P＞0.05则无显著性差异；0.01＜P＜0.05则差异显著；P＜0.01则差异极显著。

2结果与分析

本研究从浓酱兼香型不同轮次的酒醅中共分离到30株乳酸菌，归属于3个属共5个种，分别为布氏乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌和戊糖片球菌，其中布氏乳杆菌（L.buchneri）最多，为21株，占总分离菌株数的70%，是第三、第四轮出池酒醅中的优势乳酸菌。

不同轮次酒醅中分离的19株L.buchneri的耐酸、耐乙醇和耐高温生长能力存在一定差异，最适生长pH值大多在4.5左右，其中，菌株ZS-B3、ZS-B9和ZS-B10耐酸性较好，pH4.0条件下培养48h后，OD600nm值可以达到0.2；对乙醇的耐受能力在2%～10%之间，约有50%的菌株乙醇耐受能力达到6%，其中菌株ZS-B18和ZS-B16乙醇耐受能力最强，在含10%乙醇的MRS液体培养基中培养48h后，OD600nm值仍能达到0.7；最适生长温度均为37℃，在41℃条件下，L.buchneri生长均受到抑制，当温度升高到45℃时，所有菌株均停止生长。

6株布氏乳杆菌代表菌株表现出了较强的发酵产柠檬酸和乙酸的能力。其平均柠檬酸产量为3.761g/L，平均乙酸产量为4.222g/L，分别是L. plantarum ZR1的11.13倍和1.80倍。柠檬酸是良好的食物酸味剂，具有抗氧化、增加酸味、抑制细菌等作用。传统固态发酵白酒中主要呈香物质乙酸乙酯的形成又与乙酸有直接相关。对布氏乳杆菌在白酒发酵系统中的存在状态及其功能进行研究，对于调控白酒中柠檬酸和乙酸乙酯含量具有一定的指导意义。