发酵饲料菌种配比筛选与发酵工艺优化
摘要：试验通过选择枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌和保加利亚乳杆菌作为混合发酵剂发酵全价饲料，可以进一步提高饲料利用率。在确定三种菌最佳混合比例的基础上，对饲料发酵参数进行进一步优化，探讨铁脚麻鸡发酵饲料的最佳工艺，为提高养殖效益提供理论依据。
枯草芽孢杆菌是耗氧菌，发酵过程消耗大量的养分，维持厌氧的环境，促进厌氧菌乳酸菌生长，同时也抑制有害耗氧菌的生长；乳酸菌主要是产酸，对饲料质量起到关键性作用；酵母菌是兼性厌氧菌，生长环境较宽，能产酸和大量的菌体蛋白。三种菌种的功效各不相同，采用三种菌种的最佳的混合配比，能够让其发酵的饲料营养更平衡、更利于吸收。
1 材料与方法
1.1 材料
酵母菌、乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌；YPD、LB、MRS培养基、超净工作台、摇床培养箱、发酵菌种、配合饲料等试验器材。
1.1.1 固体培养基
1）YPD固体每300mL水中蛋白胨、酵母粉、琼脂糖、葡萄糖：6g、3g、6g、6g、6g单独灭菌,然后加入300mL无菌蒸馏水中在121℃灭菌。
2）LB固体每300mL水中蛋白胨、酵母粉、氯化钠：3g、1.5g、3g，在121℃灭菌锅中灭菌。
3）MRS固体体培养基18.9g/300mL在121℃进行灭菌。
4）生理盐水ac10.9%；Nacl:7.2g+800mL蒸馏水。
1.1.2 液体培养基
1）YPD液体。称酵母浸膏1g加入80mL蒸馏水中溶解，葡萄糖2g加入20mL蒸馏水中溶解，分别灭菌温度为121℃，后混合。
2）LB液体。酵母浸膏0.5g、蛋白胨1g、Nacl 1g，加无菌蒸馏水至100mL。
3）MBS液体。成品：5.224g/100mL加无菌蒸馏水，封口121℃无菌锅灭菌。
1.2 试验方法
灭菌：将配制YPD、LB、MRS培养基（固液），3个10mL离心管、100μL、1mL规格枪头、无菌生理盐水等进行灭菌；
分装：打开无菌超净工作台,三个10mL离心管做好标记，分别加入YPD、LB、MRS液体培养基8mL；
接种：将酵母菌80μg、枯草芽孢杆菌80μL、乳酸杆菌80μL分别加入到含有对应培养基的离心管中，并密封好；
培养：将酵母菌在28℃、15h、摇床培养、有氧，枯草芽孢杆菌：35℃、20h、摇床培养、有氧，乳酸杆菌：37℃、15h、静置培养、无氧。
1.3 观察与计数
培养时间到后，取出进行染色鉴定、计数。酵母菌用美兰染色法，枯草芽孢杆菌及乳酸杆菌用革兰氏染色法，染色结束后进行镜鉴。
2 结果与分析
2.1 菌种最佳配比浓度的筛选
2.1.1 平板菌落计数结果
本研究所使用的酵母菌在有氧条件下28℃摇床培养15h后进行菌落计数，枯草芽孢杆菌在有氧条件下35℃摇床培养20h后进行菌落计数，乳酸杆菌37℃静置培养15h后进行菌落计数，原菌液的含菌量结果如表1所示。
2.1.2 菌种活化与浓度梯度配制
将三种菌的含菌量分别设三个水平（见表2），按L₉（3⁴）的正交表进行设计。最后将不同配比的三种菌按1%的接种量接种到饲料中，在常温下进行为期7天的发酵。饲料水分含量为45%。具体接种方法为：将底料与菌种混匀后装入500mL罐头瓶中进行发酵，每个罐头瓶装发酵料200g，发酵完成后对发酵饲料的质地、颜色、气味等进行感官评定及菌落计数。
结合发酵饲料感官评定和活菌数测定结果，初步得出发酵用菌种配比为：酵母菌1.8×108cfu/mL、乳酸菌1.35×108cfu/mL、枯草芽孢杆菌4×1011cfu/mL。
2.2 混菌一次发酵参数的优化结果
2.2.1 发酵工艺设置与优化
本试验先活化三种菌，分别获取乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌，将三种活化菌分别制配成最佳菌种配比为酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌1.8×108、1.35×108、4×1011cfu/mL，在最佳菌种配比的条件下，以发酵温度、发酵时间、饲料水分、微生物接种量4个因素为考察因子，每个因素设3个水平，按L₉（3⁴）正交试验表进行试验设计，共9种组合，每种组合做3次重复，最后以活菌数做为评判指标。
2.2.2 活菌数的测定
称取0.6ｇ发酵饲料至装有5.4mL无菌生理盐水的10mL离心管中，在振荡器上充分震荡30min，用灭菌吸管吸取10ml至灭菌空试管中，在漩涡混合器上震荡 3min，然后吸取1mL加入到9ml无菌生理盐水中，在漩涡混合器上混合1min，进行10倍系列释，选取3个适当的稀释倍数，倾注平板，每个梯度做两个平行，恒温培养、计数，算出发酵饲料中的活菌数。发酵结束后，仔细观察，可见发酵第五天饲料质地松软、颜色为黄色，香味淡香为最佳。通过对发酵饲料的质地、颜色、气味等进行感官评定及菌落计数，并进行常规养分的检测，得出来水分含量为45%时，发酵的饲料比较好；温度在25℃-30℃的时候发酵较好，此时产生的活菌数和活性物质含量达到最优。
3 结论
综上所述，最佳菌种配比为酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌1.8×108、1.35×108、4×1011cfu/mL；铁脚麻鸡育肥期饲料发酵最佳工艺为发酵温度为25-30℃，发酵时间为5天，饲料含水量为45%。
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