导读

益生菌是一种能够抑制有害菌生长繁殖，改善肠道菌群平衡，促进营养物质消化吸收，提高宿主健康水平及饲料转化率，无毒、无害、无残留、安全、无副作用的微生物添加剂。益生菌大体上可以分为三大类: 乳杆菌属、双歧杆菌属及部分革兰氏阳性球菌，另外还包括明串球菌属、丙酸杆菌属、芽孢杆菌属及部分益生真菌。益生菌作为饲料添加剂对动物的促生长作用已被广泛认可，但也存在着很多问题，如适宜作为益生菌的菌种数量仍较少; 活菌制剂进入动物肠道后易受盐酸、胆汁酸等影响，难以发挥较好的作用; 活菌制剂在加工、运输和贮存中易失去活性，使用效果降低等。其中，益生菌制剂活菌数量是其产品质量和活性检测的重要指标之一，但极易受到吸附载体、温度、制剂类型及贮存条件的影响，从而影响产品的稳定性和使用效果。有报道显示，在40 ℃恒温条件下贮存3个月，益生菌活菌数量可急剧下降5 个数量级; 室温条件下贮存24 个月，活菌数量下降不超过2 个数量级; 低温(0～4 ℃) 条件下存贮，活菌数量基本保持稳定。如何制备稳定的菌剂，使其能够长期贮存并保持其活菌数量，是目前益生菌制剂产业亟需解决的问题之一。

短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis)是一种革兰氏阳性细菌，其细胞壁结构简单，蛋白分泌能力强，不含内毒素，在临床和环境应用方面安全，目前在生物防制、微生物保鲜及微生物降解等方面应用广泛，但关于其在益生菌方面的研究鲜见报道。Che 等研究发现，短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 首次被发现可以降低断奶仔猪的料重比、肠道大肠杆菌和沙门氏菌数量，提高乳酸菌含量。但目前对利用该菌株制备益生菌剂的研究还未开展，为获得短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 益生菌制剂的最佳制备方法，本研究探索了稳定剂、防腐剂、盐浓度和pH 对短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA制剂保存特性的影响、贮存过程中活菌数及抑菌能力变化，同时开展了该菌株芽孢产率及耐热性、抗生素敏感、抑菌及胃肠道环境耐受力的评估，旨在为扩大其应用提供科学依据。

1.1 材料

11.1 供试菌

株短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA由本实验室筛选鉴定; 靶标菌株: 金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 、大肠杆菌( Escherichia coli)及沙门氏菌( Salmonella) 均由福建省疾病预防控制中心提供。

1.1.2 培养基

发酵培养基: 豆饼粉3%、蔗糖2%、可溶性淀粉0.8%、CaCl20.5%、蛋白胨0.2%，pH7.0～7.2，由实验室自行配制。

1.1.3 溶液配制

人工胃液: 在约800 mL 水中加入稀盐酸16.4 mL，加入10 g 胃蛋白酶( 10 000 NFU/mg) 摇匀，加水稀释成1 000 mL，调pH 至3.0，用0.22 μm 无菌过滤器过滤除菌待用; 人工肠液: 磷酸二氢钾6.8 g，加500 mL 水溶解，用0.1 mol /L 氢氧化钠溶液调pH 至6.8，另取胰蛋白酶( 250 NFU/mg) 1g，加适量水溶解，两液混匀后，加水稀释至1 000 mL，0.22 μm 无菌过滤器过滤除菌待用。

1.2 方法

1.2.1 不同稳定剂对短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA

贮存的影响将黄原胶、琼脂、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵、卡拉胶、羧甲基纤维素钠、海藻酸丙二醇酯8 种稳定剂( 终浓度为2.0‰) 分别与发酵液混合，室温放置3 d 后，观察制剂外观形态并测定稳定性。将初筛得到的稳定剂进行复筛，使其终浓度为0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰，室温放置3 d 后，观察制剂外观形态并测定稳定性。

1.2.2 不同NaCl 浓度对短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA保存特性的影响

分别取100 mL 发酵液于150 mL 三角瓶中，添加0、2%、4%、6%、8%和10%NaCl，以不加NaCl 为对照。分别在0、5、10、15、20、25、30 d 取样，稀释后涂布于NA 平板，重复3 次，30℃培养48 h，统计活菌数，计算存活率及杂菌率。存活率( %) = Nt/N0×100%，式中，Nt，贮存不同时间的活菌数; N0，0 d 的活菌数; 杂菌率( %) = 杂菌数/( 短短芽胞杆菌数+杂菌数) ×100%。

1.2.3 不同pH 对短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 保存特性的影响

分别取100 mL 发酵液于150 mL的三角瓶中，在pH 分别为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 和11.0 下常温保存，分别在0、5、10、15、20、25、30 d 取样，稀释后涂布于NA 平板，重复3 次，30 ℃ 培养48 h，统计活菌数，计算存活率及杂菌率。

1.2.4 不同防腐剂对短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA保存特性的影响

分别取100 mL 发酵液于150mL 的三角瓶中，分别添加终浓度为0.1‰的双乙酸钠、苯甲酸、苯甲酸钠、丙酸铵、山梨酸、山梨酸钾、山梨酸钠、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钙11种防腐剂，对照组不添加任何防腐剂，常温保存，分别在0、5、10、15、20、25、30 d 取样，稀释后涂布于NA 平板，重复3 次， 30 ℃培养48 h，统计活菌数，计算存活率及杂菌率。

1.2.5 长期贮存过程中胶悬剂活菌数及抑菌能力的变化

取200 mL 发酵液于250 mL 蓝口瓶中，添加0.1‰柠檬酸钙、2‰黄原胶，并分别添加0、3%、6%、9%、12%、15%NaCl，调节pH 为7.0，常温保存，分别于0、10、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 d 取样。稀释后涂布于NA 平板，重复3次， 30 ℃培养48 h，统计活菌数。同时，取10、60、120、180、300 d 进行抑菌效果检测。

1.2.6 短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 的体外益生效果

1.2.6.1 菌悬液制备

将菌株活化2 次后接种于NA 液体培养基中，30 ℃、170 r /min 下振荡培养48 h，置于80 ℃水浴15 min，7 000 g 离心10 min，收集菌体; 采用PBS 缓冲液洗涤2 次，并用PBS 缓冲液悬浮即为菌悬液。

1.2.6.2 产芽孢率及耐热性

将菌株活化2 次后接种于NA 液体培养基中，30 ℃、170 r /min 振荡培养，分别在24、48、72 h 取样，测定产芽孢率; 取菌悬液1 mL，加入到9 mL PBS 溶液中，充分混匀后，100℃加热0、2、5、10、15、20、30 min 后，以无菌生理盐水按1 ∶ 10 梯度稀释，进行平板菌落计数并计算存活率。

1.2.6.3 人工胃肠液及胆盐耐受性

取菌悬液1mL 加入到9 mL 人工胃液及人工肠液中，充分混匀后， 37 ℃、170 r /min 振荡培养3 h，分别于0、3 h 取样，以无菌生理盐水按1 ∶ 10 梯度稀释，进行平板菌落计数并计算存活率。在LB 液体培养基中加入0.3%( W/V) 的猪胆盐，121 ℃灭菌20 min。取1 mL菌悬液于培养基中，37 ℃、170 r /min 振荡培养24 h，分别于0、24 h 取样，将无菌生理盐水按1 ∶ 10 梯度稀释，进行平板菌落计数并计算存活率。

1.2.6.4 抑菌作用及抗生素敏感性

将100 mL09% NA 培养基熔化并冷却到50 ℃后，加入100 μL菌浓度为1×107CFU/mL 指示菌株发酵液，涡旋震荡后倾覆在预先已凝固的NA 下层培养基上。静置数分钟后，在双层培养基平板上打孔，分别向每个孔内加入无菌水及发酵上清液各100 μL，以无菌水为空白对照， 37 ℃培养24 h，重复3 次，观察菌株生长情况并测量抑菌圈直径。

1.2.6.5 抗生素敏感试验

将含有定量抗生素的滤纸片( 头孢唑林30 μg /片、氨苄西林10 μg /片、庆大霉素10 μg /片、红霉素15 μg /片、氯霉素30 μg /片、链霉素10 μg /片、四环素30 μg /片、利福平5 μg /片、新霉素30 μg /片、多黏菌素B 30 μg /片)贴在已接种了短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 的NA培养基上， 30 ℃培养24 h，重复3 次，观察生长情况并测量抑菌圈直径。

1.3 数据分析

所有数据采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 17.0 进行统计分析，One-Way ANOVA 进行单因素方法分析，Duncan 氏法进行多重比较，结果用平均值±标准差表示，以P＜0.05 作为差异显著性判断标准。

2结果

2.1 短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 胶悬剂的制备

2.1.1 稳定剂对短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 胶悬剂的影响

由图1 可知，将2.0‰稳定剂与发酵液混合，室温放置3 d 后发现，黄原胶与琼脂胶悬效果最好，无上下分层，稳定性良好。对黄原胶和琼脂进行复筛发现，1.0‰、1.5‰、2.0‰黄原胶质地均匀，无上下分层，稳定性良好，其中2‰黄原胶沉淀率最高为26.89%，稳定性最好; 0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰琼脂均出现结块分层现象( 图2) 。因此，选用2.0‰黄原胶为稳定剂以保证胶悬剂的稳定性。

2.1.2 NaCl 浓度对短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA胶悬剂的影响

由图3 可知，随着保存时间的延长，活菌数呈递减的趋势。当发酵液NaCl 浓度为4%时，短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 初始活菌数为2.43×107CFU/mL，保存5、10、15、20、25、30 d 时，活菌数显著下降( P＜0.05) ，分别为44．31%、55．14%、39.64%、28.26%、16.05%、22.63%，30 d 时活菌数量高于其他NaCl 浓度且无杂菌。考虑到发酵液存放期间尽可能保持活菌数和减少杂菌率，选择4%NaCl 进行长期存放。

2.1.3 pH对短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 胶悬剂的影响

由图4 可知，当pH 调至1.0 时，在保存30 d 后，活菌数显著下降为0.53 × 107CFU/mL( P＜0.05) ，但存活率仍为15．01%，说明短短芽胞杆菌FJA-1501-BPA 在强酸条件也能生存; 将发酵液pH调至3.0 时，活菌数较多，当发酵液pH 调至5.0、7.0、9.0、11.0 处理30 d 后，活菌数分别为2.53×107、1.00×107、0.57×107、1.77×107CFU/mL; 当pH 调至7.0时，贮存10 d 时，其活菌数最多，显著高于贮存0、5、15、20、25 和30 d( P＜0.05) ，综合考虑细胞渗透压平衡和贮存时间，最终选择将发酵液pH 调至7.0 时进行长期存放，尽可能保持活菌数和减少杂菌率。

2.1.4 防腐剂对短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 胶悬剂的影响

由表1 可知，在处理30 d 后，不同防腐剂处理组的活菌数略有不同，但活菌数均在1×106CFU/mL 以上且无污染杂菌。这可能是短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 自身产生的抑菌物质对其控制杂菌污染产生作用。因此，选择0.1‰双乙酸钠、0.1‰山梨酸钾、0.1‰柠檬酸钙添加于发酵液中，进行长期保存。

2.2 长期贮存过程中短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 活菌数及抑菌能力变化

2.2.1 活菌数

随着保存时间的延长，活菌数略有增加，其结果见表2。由表2 可知，初始第0 天，盐浓度为0、3%、6%、9%、12%、15%时的活菌数分别为8.08、8.10、8.10、8.08、8.07、8.08 log( CFU/mL) ; 保存300 d后，活菌数分别为8.76、8.62、8.70、8.67、8.46、8.52 log( CFU/mL) 。同一浓度保存不同时间，活菌数显著升高( P＜0.05) ，但总体来说，添加一定量的NaCl 有利于短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA的长期贮存。

2.2.2 抑菌能力

由表3 ～ 5 可知，同一NaCl 浓度下，随着贮存时间的延长，该菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌活性有所降低，但不同的盐浓度对长期贮存后的抑菌活性影响不大，因而制备菌剂时，选择4% NaCl 进行贮藏。

2.3 短短芽胞杆菌胶悬剂益生特性评价

2.3.1 发酵水平

由表6 可知，短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 在发酵72 h 时，孢子数显著高于发酵24 及48 h( P＜0.05) ，发酵24、48 及72 h 产孢率分别是0.87%、7.58%、60.82%，说明该菌株具有良好的产芽孢能力。

2.3.2 耐热性

由表7 可知，在100 ℃加热0、2、5、10、15、20、30 min 后，菌株耐热率分别为100.00%、36.41%、12.66%、1.97%，加热15、20、30min 后，菌株耐热率均＜1%，加热30 min 后活菌数仍达到3.06 log( CFU/mL) ，说明该菌株具有一定的耐热性。

2.3.3 人工胃肠液和猪胆盐耐受性

由表8 可知，短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 在人工胃液中保持3 h 后存活率为23.16%，活菌数量有一定的降低，说明其对人工胃液中具有一定的耐受性; 在人工肠液中作用3 h 后，其存活率达到48.62%，说明该菌株对人工肠液具有良好的耐受性; 该菌株在猪胆盐环境中耐受性最好，在0.3%( W/V) 的猪胆盐环境中培养24 h 后，菌株生长良好，存活率达到98.83%。

2.3.4 抑菌谱

由图5 可知，该菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌圈直径分别为21.42、21.33、15.83 mm，说明，该菌株对动物病原菌具有较好地抑制作用。

2.3.5 抗生素敏感性

由图6 可知，短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 对红霉素、头孢唑林和庆大霉素极度敏感，其抑菌圈大小均达20 mm，对新霉素、利福平、氯霉素、四环素和多黏菌素B 高度敏感，抑菌圈直径为15～20 mm; 对链霉素中度敏感，抑菌圈直径为10.1～15.0 mm; 对氨苄西林为耐药。

3讨论

延长益生菌制剂的保质期，控制杂菌率有多种方法，如控制温度、pH、盐度及添加防腐剂等。菌活力强、活菌数量大，才能有效维持胃肠道微生物生态环境平衡，发挥最大的益生作用。郭照辉在进行畜禽用凝结芽孢杆菌( Bacillus coagulan) 液体菌剂杂菌控制及保存期初步研究时，在凝结芽孢杆菌发酵液中添加0.5%苯甲酸钠，调节发酵液pH 为4.0，置阴凉干燥处常温保存270 d 发现，菌株存活率为40.06%，凝结芽孢杆菌是一种同型乳酸发酵的绿色微生物饲料添加剂，在酸性条件下( pH 4.0) ，凝结芽孢杆菌孢子对热几乎没有耐受性，而且生长受到抑制。而短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 在pH 3.0 ～ 15.0 时均能生长，其生长的pH 范围比目前报道的益生菌菌株更广，因而可能更适合作为益生菌菌株进行应用。此外，本研究选择使用0.1‰柠檬酸钙、0.1‰山梨酸钾、0.1‰双乙酸钠3 种防腐剂组合并且添加4% NaCl，为增强产品的稳定剂还添加了2.0‰黄原胶，常温保存300 d 时，菌株存活率为100%，明显优于郭照辉研究结果。因此，本研究提供了一种益生菌液体制剂保存的新方法，可以延长菌剂的贮藏时间，便于运输。

芽孢杆菌作为益生菌饲料添加剂的核心组成成分，其自身益生效果的优劣是决定后期发酵产品最终应用效果的关键因素。产芽孢率高、耐热性强且能在工业化发酵生产后保持一定数量的活菌是作为益生菌条件之一。王巧丽等研究发现，猪源益生罗伊氏乳杆菌在70 ℃水浴培养2 min 时菌株基本死亡，而高书锋等研究发现，凝结芽孢杆菌W-02 益生菌在80 ℃水浴30 min，活菌数为1×105～1×106CFU/mL。本试验结果发现，短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 在100 ℃ 水浴加热30 min，活菌数仍为3.06 log( CFU/mL) ，由此可知，短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 耐热性优于乳酸杆菌，可以保证其发酵后存活足够数量的菌体。胃酸和胆汁具有抗菌作用，益生菌只有能够抵御低pH 和高胆汁盐时才能在肠道内存活并正常发挥生理作用。短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 在人工胃液、肠液、0.3%猪胆盐培养3、3、24 h 后菌株存活率分别为23.16%、48.62%、98.83%，其在人工胃肠液中存活率虽较低但不致死。闵钟熳等发现，芽孢杆菌B5329、B22、B544，在人工胃液中处理4 h，存活率分别为12.02%、7.94%、6.03%，在人工肠液、0.3%猪胆盐中存活率维持在较高的水平。本试验中短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 与上述3 株芽胞杆菌一样具有耐胃肠液及胆盐能力，能够在肠道内存活。维持肠道微生态平衡是益生菌的作用之一，故益生菌菌株要具备抑制病原菌的特性。短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈直径分别为21.42、21.33、15.83mm，与李善仁等的研究结果一致，其发现3 株芽孢杆菌作为益生菌对肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的平均抑菌圈直径分别为15.56、15.50、23.55mm。以目前畜牧养殖现状来看，不同动物的不同生长阶段还需要添加一定量的抗生素，所以需要考虑抗生素与益生菌是否存在协同作用。短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 对链霉素、氨苄西林不敏感; 而对红霉素、头孢唑啉、庆大霉素、新霉素、利福平、氯霉素、四环素和多黏菌素B 均较敏感。李雅丽等发现6 株芽孢杆菌对链霉素、氨苄西林等10 种常用饲用抗生素均较敏感，建议避免与抗生素同时使用。短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 可能携带了链霉素、氨苄西林耐药性基因，该菌株与此类抗生素可以在饲料中同时添加，互不影响。

4结论

添加4%NaCl、0.1‰柠檬酸钙、0.1‰山梨酸钾、0.1‰双乙酸钠、2.0‰黄原胶，调节pH 为7，可获得长期保存的短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 胶悬剂配方，有望为益生菌液体制剂的制备提供新的方法。短短芽胞杆菌FJAT-1501-BPA 对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌3 种肠道病原菌具有抑制作用，具有产孢率高、耐热性强、耐酸、耐胆盐的特性，可与链霉素、氨苄西林同时使用，具备了优良益生菌的条件。