浙江大学秦楠研究员、李兰娟院士及法国农业科学院Dusko Ehrlich教授在Nature杂志上撰文答同行学术质疑，与弗吉尼亚州立联邦大学及McGuire医学中心的Jasmohan S. Bajaj及Patrick M. Gillevet教授之间展开了激烈的学术碰撞。争论的焦点为去年7 月24 日，原作者在Nature上发表的"Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis"一文，该研究通过定量宏基因组的方法揭示了肠道菌群与肝硬化的秘密，给全球医学科技研究提供新思路。

现代医学根据肝硬化疾病的严重程度将其分为代偿患者(Compensated Patient， CP) 及失代偿患者 (Decompensated， DP，是肝硬化非常严重或晚期的病人)。原Nature论文中对失代偿患者的肠道菌群进行了定量宏基因组检测（实验组中存在65%的失代偿患者，验证组中存在76%的失代偿患者）。基于这种实验分组，Bajaj教授对"基于肠道菌群进行肝硬化诊断方法"的可靠性提出了质疑，而且，Bajaj教授认为：对于失代偿患者的诊断来说，临床上一些简单便宜的方法就能判断，不需要通过复杂的定量宏基因组方法获得标记物（15 个高特异性和灵敏性的微生物基因）。

肠道菌群热点问题在Nature上引起中外科学家激烈辩论

为了证明这种基于肠道菌群肝硬化诊断方法的可靠性，秦楠博士在代偿性患者中进行了检验。这些代偿性肝硬化病人里面没有肝腹水和肝性脑病这些重症肝硬化病人。在原Nature论文中，基于98个病人、83个健康人的数据，提出了利用了15个微生物标记物（biomarkers）构建一个医学分类器的诊断方法，这个分类器可以很好的将实验组（discovery cohort，AUC=0.95）和验证组（validation cohort，AUC=0.94）中的病人和健康人区分出来。在秦楠博士的检验实验中，这种方法对于代偿性肝硬化病人（CP，数量有54或57个病人）分类效果依然很好，AUC达到了0.95。这表明尽管原实验样品中包含很多DP样品，但并不影响分类器的准确性。

对于原文中宏基因组的分析结果，Bajaj教授也提出了自己的质疑。Bajaj教授通过对meta数据的进一步分析以及另外360个样本的分析认为CP与DP的肠道菌群间存在很大差异。原Nature论文通过基因标记物的聚类分析共发现66个细菌基因簇（MGS），其中 28 种MGS与肝硬化密切相关， 38 种与健康人密切相关。Bajaj教授通过LEfSe对MGS聚类结果进行分析，结果发现17种MGS在CP和DP之间存在明显差异，10种MGS在DP中富集，另7种MGS在CP中富集（图1a）。另外，Bajaj教授收集了年龄相近的接近300例粪便样品（45个健康人，年龄为54±3；171个代偿患者，年龄为54±3，平均Child-Pugh评分为6；141个代偿患者，年龄为55 ±2，平均Child-Pugh评分为9）进行16S核糖体RNA基因焦磷酸测序（MTPS），结果发现CP与DP的肠道菌群间存在很大差异。

究竟CP与DP的肠道菌群之间的差异性有什么区别？能否通过微生物标记物对健康人和肝硬化患者进行区分？对此，秦楠博士及法国的合作者对两组不同程度疾病的病人组中存在的MGS进行了更深入的分析。

秦楠博士在这两组不同严重程度的病人组中发现，有66个种在他们两组中都有富集，另外有30个MGS在实验组（discovery cohort，CP n=45； DP n=54）中发现，不过其中有13个并没有出现在之前的66个种里。并且可以利用这79个种（66+13=79）构建更好的医学分类器。重新通过14个MGS构建了新的分类器，依然可以将失代偿性肝硬化病人（DP）和代偿性肝硬化病人（CP）在实验组（discovery cohort，CP n=45； DP n=54）以AUC=0.87较好地区分出来，在验证组（validation cohort，CP n=9； DP n=16）以AUC=0.84较好地区分出来。这些分析证实了之前Nature文章的发现，即肠道菌群的改变确实和疾病的严重程度有关。但它并没有像Bajaj教授说的那样菌群随疾病的变化是突变式的，更有可能是渐进式的。

另外，Bajaj教授也对影响肠道菌群的其它因素提出了疑问。他认为，药物和阻断剂等会对检测结果有重要影响，并怀疑在原文中发现的健康人和病人的菌群差异有可能是药物和阻断剂导致的。

但秦楠博士的进一步分析发现这个分类效果并不受药物影响，在用药组（数量有52个病人）和非用药组（数量有71个病人），分类效果对应的AUC也都达到了0.95，效果很好。对于β阻断剂用者（数量11人）和没有用β阻断剂者（数量112人），AUC分别为0.95和0.96。对于使用PPI（数量70人）和不使用PPI者（数量53人），对应的AUC分别为0.96和0.93。这些都说明原Nature论文中利用微生物标记物构建的分类器效果不受这些因素的影响，仍旧可以很好的将肝硬化病人和健康人区分开来，作者们认为这是基于16S核糖体RNA基因测序所不能得到的信息。

Bajaj教授还提出了很多影响肠道菌群的因素，包括肝性脑病，感染以及饮食，认为这些会很大干扰原Nature论文中的研究结果。

对此，秦楠博士及法国合作者在回文中解释道：短期的营养改变（比如医院饮食）一般对肠道微生物只有非常有限的影响，长期的饮食习惯对菌群才有更大的影响，但在选取的中国肝硬化患者和健康对照组中，这些都没有明显的不同。

秦楠博士表示，糖尿病患者已经被排除在他们的选样范围之外。口腔菌群进入肠道并没有在先前Nature发表的T2D文章里报道过，虽然应用定量宏基因组学技术他们很自然就能揭示它们存在。

总而言之，在"Decompensated cirrhosis and microbiome interpretation"一文中，秦楠博士及合作者对Bajaj教授的疑问进行了坚定的反驳。同时呼吁广大研究人员，在菌群研究中，不能简单的认为菌群的改变仅仅是患病的"偶然因素"，忽视真实存在的与肝硬化疾病具有强关联证据的肠道菌群的改变。秦楠博士认为对于代偿性肝硬化病人（CP）的检测，基于肠道菌群进行非创伤性医学诊断手段，应该逐渐代替具有损伤的旧式的诊断手段比如肝组织活检。另外，相较于简单的16S核糖体RNA测序，定量宏基因组的方法分辨率更高，可以从菌群及功能基因多方面研究疾病与肠道菌群之间的关系。

第一作者为浙大一院传染病诊治国家重点实验室及感染性疾病诊治协同创新中心秦楠博士。通讯作者为浙大一院传染病诊治国家重点实验室及感染性疾病诊治协同创新中心主任李兰娟院士及法国农业科学院Metagenopolis研究所主任S. Dusko Ehrlich 教授。

来源:生物谷