导读

　　仔猪断奶后，生长发育快，但消化道发育不全，免疫力低，易造成厌食、下痢、生长停滞、失重甚至死亡。乳酸菌饲料制剂具有维护动物肠道健康、缓解不良应激、调节机体代谢和改善畜产品品质的功能，是我国2008年批准使用的饲料添加剂。但由于乳酸菌饲料制剂生产工艺不完善，尤其是干燥技术，乳酸菌制成粉末制剂后大量失活，应用效果不好，一直未得到大规模应用。乳酸菌活菌制剂的干燥技术主要有冷冻干燥技术、喷雾干燥技术、真空干燥和流化床干燥技术。目前市场上常见的乳酸菌菌粉是通过冷冻干燥制备而成，但是冷冻干燥存在生产不连续、成本较高、周期较长、耗能大等问题。相比于冷冻干燥，喷雾干燥具有可连续生产、成本较低、高效等特点；但由于喷雾干燥技术采用高温气化干燥，对不耐热的菌株破坏较大。课题组前期通过紫外诱变和高温驯化获得一株耐消化、耐高温的嗜酸乳杆菌菌株，将其发酵液通过喷雾干燥技术降低水分含量，并通过喷雾干燥工艺优化提高其存活率，可在降低成本的前提下，保证其应用效能。

　　因此，本研究在此基础上进一步通过单因素实验筛选乳酸菌制剂的最优包埋壁材；并通过正交实验优化喷雾干燥工艺；然后对乳酸菌制剂微胶囊的外观结构、包埋率和稳定性进行评估；最后以断奶仔猪实验考察乳酸菌制剂的应用效果。

　　1材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌种

　　嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophillus)FZU-LA1301X，课题组前期筛选保存。

　　1.1.2 培养基

　　MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，牛肉膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，吐温80 0.1 mL，七水硫酸镁0.58 g，四水硫酸锰0.025 g，蒸馏水1 000 mL。121℃灭菌20 min。

　　MRS固体培养基：在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂。

　　1.1.3 乳酸茵饲料制剂微胶囊壁材的选择

　　1.1.3.1 微胶囊壁材及浓度的选择

　　以阿拉伯胶、明胶、β-环糊精、麦芽糊精和可溶性淀粉5种不同材料作为壁材，分别配置质量分数为10％，15％和20％的溶液，使用均质机在10 000 r/min速率下均质3 min，形成稳定、均匀且流动性好的壁材溶液。通过测定喷雾干燥后菌粉中的活菌数，选择较优的壁材及浓度。

　　1.1.3.2 嗜酸乳杆菌微胶囊的制备

　　将壁材溶液在室温下与等体积的嗜酸乳杆菌菌悬液(浓度约为4.50×108CFU/mL)}昆合，充分搅拌混合后在进口温度160℃、进料速率500 mL/h的条件下进行喷雾干燥制备嗜酸乳杆菌微胶囊，然后根据各壁材在喷雾干燥过程中的性状表现选取最佳壁材。

　　1.2 方法

　　1.2.1 正交实验优化喷雾干燥工艺

　　乳酸菌制剂喷雾干燥过程是先将乳酸菌菌悬液与壁材溶液混合形成均匀的料液，然后料液经蠕动泵进入喷雾干燥雾化器形成细小的雾滴，再与高温的热空气接触，在极短的时间内蒸发水分，经过旋风分离器，最后得到乳酸菌菌粉。由于喷雾干燥工艺条件如进口温度、进料速率和壁材比例等，会对菌粉中的活菌数产生直接影响，所以通过单因素实验和正交实验对各工艺条件进行优化。实验中选择了L9(34)正交表。4个因素为A进口温度、B进料速率、C壁材比例(阿拉伯胶：麦芽糊精)和D壁材浓度，详见表1。

　　1.2.2 微胶囊包埋率和稳定性测定

　　包埋率是指微胶囊中的活菌数与产品中的活菌数的比值。采用低温高速离心机在4℃，1 000 r/min速率下离心20 min，离心沉淀微胶囊，未被包埋的菌体处于上清液中，然后通过涂布培养法，分别测定产品中的总活菌数和沉淀中的活菌数，来计算包埋率。

　　稳定性是含活菌制剂微胶囊质量评价的重要指标，为评价微胶囊的货架稳定性，将喷雾后的微胶囊分别置于室温(25℃)和4℃条件下贮藏90 d，并定期测定其活菌数。

　　1.2.3 微胶囊产品的外观测定

　　利用Phenom G2 pro飞纳台式扫描电子显微镜对微胶囊产品的外观进行表征。

　　1.2.4 动物实验

　　1.2.4.1 断奶仔猪生长性能测定

　　300只断奶仔猪(3周龄)分成2组(每组150只)：一组对照组，喂食基础日粮；一组乳酸菌组，在基础Et粮中添加100 g/t喷雾干燥乳酸菌粉(活菌数为8.70 LogCFU/g)，试验期30 d。试验期间观测试验动物的生长性能，包括：平均日增重、平均日采食量、料重比、腹泻率和死亡率。

　　1.2.4.2 断奶仔猪粪便样品微生物测定

　　试验结束时，各组随机采集新鲜粪便样品，分别用MRS培养基和伊红美蓝培养基通过涂布培养法测定其中的乳酸菌及大肠杆菌的活菌数。

　　2结果与讨论

　　2.1 乳酸菌饲料制剂喷雾干燥壁材的选择

　　2.1.1 微胶囊壁材的选择

　　在微胶囊的制备中，壁材特性是影响微胶囊特性至关重要的因素，理想的壁材具有高度溶解性、无毒无害、优良的乳化性质、成膜性好、溶液黏度低及成本低廉等优点。本实验选取阿拉伯胶、麦芽糊精、可溶性淀粉、β-环糊精和明胶5种常用微生物微胶囊壁材进行喷雾干燥制备乳酸菌饲料制剂。在喷雾干燥过程中发现，明胶在常温时易凝结成胶状，无法形成流动性好的体系，而β-环糊精在较高浓度时会呈现颗粒状，较难形成均匀的体系，不利于之后的喷雾干燥，且在喷雾干燥过程中，微胶囊产品可能会在喷雾干燥塔的塔壁上停留而导致活菌数下降，所以本课题选择黏度较低，分散均匀的阿拉伯胶、麦芽糊精、可溶性淀粉作为主要的壁材进行研究。

　　2.1.2 壁材浓度及组合比例的优化

　　2.1.2.1 壁材浓度的优化

　　在确定阿拉伯胶、麦芽糊精和可溶性淀粉作为喷雾干燥的壁材后，在进口温度160℃，进料速率500 mL/h条件下，以活菌数为指标通过单因素实验筛选壁材的最佳浓度，结果见图1。由图1可知，阿拉伯胶和可溶性淀粉在15％时具有较好的喷雾效果，麦芽糊精在15％、20％和25％时活菌数差异不大；且阿拉伯胶比麦芽糊精和可溶性淀粉具有较好的保护效果。

　　2.1.2.2 壁材组合及组合比例的优化

　　将阿拉伯胶、麦芽糊精和可溶性淀粉按1：1的比例两两组合，配置浓度为15％的壁材溶液，与等体积的嗜酸乳杆菌菌悬液混合，在进口温度160℃、进料速率500 mL/h的条件下进行喷雾干燥，并以产品的活菌数为指标，筛选最佳壁材组合，结果见图2。阿拉伯胶/麦芽糊精组合的保护效果最好，产品的活菌数为8.54 LogCFU/g。

　　将阿拉伯胶、麦芽糊精按1：7、1：8、1：9和1：10的比例混合，配置质量分数为15％的壁材溶液，与等体积的嗜酸乳杆菌菌悬液混合，在进口温度160℃、进料速率500 mL/h的条件下进行喷雾干燥，并以产品的活菌数为指标，筛选最佳壁材配比浓度，结果见图3。可以发现，当阿拉伯胶：麦芽糊精=1：7时喷雾效果最好，活菌数为8.62 LogCFU/g；但四种组合比例的活菌数差异并不显著。

　　2.2 乳酸菌饲料制剂喷雾干燥条件的优化

　　在喷雾干燥过程中，除了壁材种类、浓度和组合比例会影响喷雾效果，喷雾干燥的工艺条件也是重要的影响因素。本实验以嗜酸乳杆菌活菌数为指标，通过正交实验来确定最佳的进口温度、进料速率、壁材组合比例和壁材浓度，结果见表2。

　　由表2可知，极差R的排列顺序为：进口温度、壁材浓度、进料速率、壁材组合比例。经分析。最佳喷雾条件为A1D2B1C3，即进口温度160℃、壁材质量分数20％，进料速率400 mL/h和壁材比例1：9，对A1D2B1C3组合进行验证实验，喷雾后活菌数为8.70 LogCFU/g。

　　2.3 乳酸茵饲料制剂微胶囊品质评估

　　2.3.1 微胶囊外部结构

　　采用扫描电镜对乳酸菌饲料制剂微胶囊产品进行形态观察，结果如图4所示。微胶囊多为球形或椭圆球形，直径约为5μm，表面可能由于干燥时高温脱水导致凹凸不平。

　　2.3.2 微胶囊包埋率

　　微胶囊的包埋率是评价微胶囊质量的重要指标之一，通过1.2.2中的方法计算喷雾干燥后微胶囊的包埋率。实验中得到的微胶囊平均包埋率为72.8％。

　　2.3.3 微胶囊稳定性

　　将喷雾干燥制备的微胶囊分别置于常温(约25℃)和4℃条件下贮藏，并定期测定其活菌数，结果如图5所示。由图可知，无论是在4。C还是常温保存，嗜酸乳杆菌的活菌数都呈下降趋势。4℃贮藏时下降较缓，第45 d活菌数为7.0 LogCFU/g，第90 d时活菌数为6.23 Log CFU/g；而常温下贮藏15 d活菌数大约下降一个数量级，第30 d时活菌数为6.08 LogCFU/g

　　2.4 动物实验评估乳酸菌饲料制剂的应用效果

　　通过断奶仔猪动物实验评估乳酸菌饲料制剂的应用效果，结果见表3。实验结果发现，经30 d喂食，实验组仔猪的日均增重显著高于对照组(P<0.05)；在腹泻率和死亡率方面，与对照组相比，实验组的腹泻率和死亡率分别下降57.55％和40.03％，可见在饲料中添加乳酸菌可以促进仔猪生长，防治仔猪腹泻，降低断奶仔猪的死亡率。

　　Davis等认为在饲料中添加乳酸菌能改变动物消化道的菌群组成。乳酸菌能够通过产酸降低肠道的pH值，促进蛋白酶等消化酶的分泌，有利于机体对营养物质的吸收，从而促进机体生长。张乃锋等发现在饲料中添加植物乳杆菌能显著提高生长猪的生长性能；肖宏德等在断奶仔猪的日粮中添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌复配而成的益生菌制剂代替抗生素，发现能达到与抗生素持平的促生长效果。

　　乳酸菌与大肠杆菌的数量比值被认为是评价动物消化道微生物平衡的重要标志，乳酸菌产生的有机酸能降低肠道pH值，抑制大肠杆菌等肠道病原菌的生长。索成等给断奶仔猪喂食添加了植物乳杆菌ZF316的日粮后，发现增加了仔猪消化道中的乳酸菌数量，且降低了大肠杆菌的数量，与本实验结果相符合。

　　乳酸菌制剂对断奶仔猪粪便乳酸菌和大肠杆菌的影响如表4所示。与对照组相比，实验组的仔猪粪便中乳酸菌数量显著高于对照组，而大肠杆菌数量低于对照组。

　　3结论

　　本研究利用课题组前期开发的耐消化、耐高温的嗜酸乳杆菌菌株，通过喷雾干燥技术开发低成本的高稳定性乳酸菌饲料制剂，以期将其运用于断奶仔猪的饲养，以降低仔猪在断奶后的腹泻率和死亡率。通过单因素实验和正交实验确定了乳酸菌饲料制剂的最佳制备条件为：以质量分数为20％的阿拉伯胶和麦芽糊精按1：9的比例混合作为壁材，在进口温度160℃，进料速率400 mL/h条件下进行喷雾干燥。最终的微胶囊产品的嗜酸乳杆菌活菌数为8.69 LogCFU/g；颗粒直径约5txm，包埋率为72.8％；在25℃室温下贮藏30 d，嗜酸乳杆菌活菌数为6.08 LogCFU/g。通过断奶仔猪动物实验评估产品的应用效果发现，该产品能有效地促进仔猪生长，降低仔猪的腹泻率和死亡率；并且仔猪粪便中的乳酸菌与大肠杆菌的比值明显高于对照组。

　　因此，整体而言，该乳酸菌饲料制剂具有较好的常温稳定性，且应用效果突出，具有替代传统酸化剂的潜力，市场前景广阔。